延安市宝塔区耳聋人群耳聋基因突变调查分析

杜伟平，杨 杰，钟 瑛

(1.延安大学附属医院检验科，陕西 延安 716000；2.延安市人民医院，陕西 延安 716000)

我国残疾人口数量庞大，据我国2006年第二次全国残疾人抽样调查结果数据显示，我国听力障碍人数高达2780万，居各类残疾之首[1]。耳聋成为威胁人类健康以及致残的最常见的疾病之一，给患者自身以及家庭带来诸多不稳定因素。临床上根据是否合并其他系统的疾病将遗传性耳聋又可分为综合征型耳聋与非综合征型耳聋，其中非综合征型耳聋占比较大，达到60%～70%[2]。我国解放军总医院聋病分子诊断中心自2003年起在我国28个省市开展了大规模的耳聋分子流行病学调查，结果显示GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA及GJB3为导致我国遗传性耳聋的主要四个致聋基因[3]。本研究通过对延安市宝塔区耳聋人群四个耳聋相关基因的九个突变位点：GJB2(35delG、176delG、235delC、299delAT)、SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G)、12SrRNA(1494C>T、1555A>G)、GJB3(538C>T)进行检测，了解导致延安市耳聋人群致病的主要突变基因，为后续该地区开展临床治疗及基因预防检测提供数据依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年9月至2018年4月在延安大学附属医院耳科筛选的耳聋人群以及宝塔区聋哑学校的耳聋学生共297例，进行相应临床检测排除外伤等致病因素导致的耳聋及综合征型耳聋，共筛选出NSHL耳聋人群146例，其中男性84例，女性62例；年龄8个月～37岁，平均年龄14±3.2岁。所有研究对象均于肘静脉采集患者外周静脉血2 mL，

EDTA-K2抗凝。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 TC-96型PCR扩增仪由杭州博日提供，生物安全柜由济南鑫贝西提供。晶芯BloMixerⅡ芯片杂交仪、slidewasher24芯片洗干仪、晶芯LuxScan-10K/B微阵列芯片扫描仪均来自于北京博奥生物集团有限公司。

1.2.2 试剂 DNA提取试剂盒(康为世纪CW0544非柱式血液基因组提取试剂)，遗传性耳聋基因检测试剂盒(微阵列芯片法)来自北京博奥生物集团有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA提取 采用康为世纪CW0544非柱式血液基因组提取试剂盒进行DNA提取，提取步骤参照试剂盒提供的使用说明进行。

1.3.2 基因点阵排布 根据已经发现并经解放军总医院全国流行病学调查结果确证的遗传性耳聋突变热点信息，设计了针对中国人群常见的四个基因相对应的九个位点GJB2(35delG、176delG、235delC、299delAT)、SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G)、12SrRNA(1494C>T、1555A>G)、GJB3(538C>T)检测的微阵列探针排布图，如表1所示。

表1 芯片各探针排位图

注：QC、PC、BC和NC分别代表表面化学质控、杂交阳性对照、空白对照以及阴性对照

1.3.3 基因扩增 DNA提取后采用杭州博日TC-96型PCR扩增仪进行扩增，DNA扩增完后用NanoQTM微型分光光度计进行DNA含量检测，检测合格后进行杂交检测，具体循环过程如下表：

PCR扩增反应循环参数：

37℃ 10min 1cycles

95℃ 15min 1cycles

60℃ 10min 1cycles

12℃ 1cycles

1.3.4 杂交、洗片 将PCR变性产物混合液加入芯片的点阵区域，封闭杂交盒，立即水平放入50℃预热的杂交仪中杂交1 h，杂交完毕后按照洗干程序进行洗片甩干。

1.3.5 扫描及结果判断 用晶芯LuxScan-10K/B微阵列芯片扫描仪进行芯片扫描，检测GJB2、SLC26A4、12SrRNA、GJB3四基因九位点的突变情况，结果由微阵列芯片扫描仪系统自动判读。

2 结果

2.1 146非综合征型耳聋患者基因芯片检测结果

146例非综合征型耳聋患者耳聋基因芯片检测结果显示：未突变者101例，突变者45例，检出率为30.82%(45/146)。耳聋基因突变者中共检出GJB2基因突变者25例，检出率为17.12%。SLC26A4基因突变者17例，检出率为11.64%。12SrRNA基因突变者3例，检出率为2.06%。GJB3基因未检出突变(见表2)。

表2 基因突变检测结果

2.2 四个基因9个位点突变情况检测结果

耳聋基因突变者中共检出GJB2基因突变者25例，占总突变数的55.55%；包括235delG纯合突变7例，235delC单杂合突变8例，299delAT纯合突变3例，299delAT单杂合突变1例；其中含GJB2的双杂合基因突变者6例，235delC复合176delG突变2例，235delC复合239delAT突变4例。SLC26A4基因突变者17例，包括2168A>G纯合突变1例，2168A>G单杂合突变1例，IVS7-2A>G纯合突变4例，IVS7-2A>G单杂合突变10例。3例耳聋患者检测出携带有mtDNA12SrRNA基因突变，包括1494C>T纯合突变1例，1555A>G纯合突变2例，本实验中未检测出携带有GJB3基因突变者，可能与受检者数量较少有关(见表3)。

表3 基因突变位点检测结果

3 讨论

我国幅员辽阔，基因多态性又在不同的地域和民族有着不同的特点，我国残疾人群数量庞大，尤其是听力缺陷人群。在耳聋人群中除遗传性耳聋外，其他因素导致的耳聋大多难以控制，无法进行早期干预，而遗传性耳聋可通过检测父母的突变基因及其相应突变位点后采用PGS的方式进行生育，减少耳聋患儿的出生。在中国NSHL人群中常染色体隐性遗传占比75%～80%，常染色体显性遗传约10%～20%，性连锁遗传占1%～5%以及线粒体母系遗传1%～2%[4]。本研究通过对延安市146例NSHL耳聋患者耳聋基因进行检测，以期获取本地区耳聋人群耳聋基因基本突变谱，了解导致延安市耳聋人群致病的主要突变基因，为后续该地区开展临床治疗及基因预防检测提供数据依据。

本研究结果显示GJB2基因突变者25例，突变率为17.12%，是导致该地区NSHL人群致聋的主要突变基因，235delC位点突变占该基因突变的83%，为GJB2的主要突变位点，未发现35delG基因突变。中国流行病学调查结果数据表明，中国耳聋人群中GJB2基因突变率为21.6%[5]，本次实验结果接近全国调查数据。该基因突变位点较多，在各地区的突变率也相差较大，研究发现欧美人群中Cx26基因突变多为30 delG或35 delG的热点突变，在地中海国家和美国的NSHL患者中占60%～85%，在中国人群中尚未发现该突变位点[6]。研究中共发现6例GJB2的复合杂合基因突变，复合杂合突变是指个体带有突变类型互不相同而位于同源染色体同一位点上的一对等位基因，该类型相比单突变位点具有较高的患病率，应高度重视。在我国GJB2基因突变常导致重度或极重度耳聋，约50%常染色隐性遗传NSHL患者由GJB2基因突变所致[7]，这表明若有一方基因型为杂合基因，与具有相同基因型的携带者进行婚配，后代患病的概率为25%，通过产前耳聋基因诊断指导生育，可显著降低生育患儿的几率。只由GJB2基因突变一种因素导致的耳聋，其听觉中枢和耳蜗神经属于正常，适合人工耳蜗植入，可显著提高语言理解能力。

SLC26A4基因突变者17例，检出率为11.64%，IVS7-2A>G为其主要突变位点。SLC26A4基因属常染色体隐性遗传，其突变常引起感音神经性听力障碍，造成中度或极重度耳聋[8]。SLC26A4基因突变可导致Pendred综合征与大前庭水管综合征(EVAS)，前者表现为耳聋并伴有甲状腺的肿大，后者仅表现为耳聋。我国EVAS患者的SLC26A4基因检出率高达97%，常见突变位点为c.919A>G，占所有突变类型的57.63%。因SLC26A4外显子较多，因此明确主要突变位点可以提高耳聋基因的筛查效率。前庭导水管是联系颅腔和内耳的通道，因其异常扩大，凡可引起颅内压变化的如头部碰撞、感冒等因素均可导致EVAS患儿听力下降。因此早期诊断可以提醒家长做好患儿监护，防止由外界因素导致患儿病情的加重[9]。崔庆佳等[10]发现SLC26A4基因突变的耳聋患儿年龄段大多集中在1～3岁，出生时常拥有接近正常的听觉，早期的基因筛查以及正确的生活指导可大大降低外力因素致聋以及因聋致哑的风险。

本研究有3例患者检测出线粒体12SrRNA基因突变，突变率2.06%。线粒体基因属于母系遗传基因，可通过母亲遗传给下一代，而男性不会遗传。氨基糖苷类抗生素毒性耳聋的发生与其突变有着密切的关联，部分患者对氨基糖苷类药物异常敏感，服用时药物积累于耳蜗和前庭后，与12SrRNA结合最终导致细胞的损伤与凋亡，继而影响听力[11]。因其具有母系遗传的特点，不遵循孟德尔定律，对家庭中女性成员的检测至关重要，每一个携带者背后的广大家族体系中的所有亲代女性均携带该突变基因，可通过指导用药，知识普及，遗传咨询，使其携带该基因但不一定致聋。

GJB3基因属常染色体显性或隐性遗传性非综合征型耳聋基因，被认为与高频听力下降有关，主要会引起迟发听力损失。我国本土克隆和鉴定的第1个耳聋致病基因GJB3基因在各地研究中的突变率并不高[12]，仅有1.85%[13]、0.94%[14]，本研究中未发现GJB3基因突变者，可能与样本量或地区差异有关。

在该研究中，突变基因总检出率为30.82%，仍有多半数耳聋人群未检测出耳聋基因突变。由于该研究只检测了遗传性耳聋常见的的九个突变位点，具有一定的局限性，并未涵盖与遗传性耳聋相关的全部突变位点，当检测者结果为野生型时，并不能排除存在其他基因突变位点的可能，需进行进一步的研究。耳聋病人因其自身情况特殊，给国家和社会造成了很大的经济负担，因此利用基因遗传模式对耳聋患者进行婚育指导以及后代耳聋风险的预估显得格外重要。通过耳聋基因检测相关知识的普及及推广，进行必要的基因筛查与干预，阻断遗传性耳聋在人群中的传递与发病。同时对于不同民族和地区人群应采用符合各地区基因特点的检测项目来提高检测效率，提高其应用价值。