甘草内生真菌GRE9挥发性成分分析

许哲祥　姜硕　王宇晴　郑春英

摘要 [目的]比较甘草内生真菌GRE9与宿主植物甘草挥发性成分的相关性。[方法]利用气相-质谱法分析甘草内生真菌GRE9发酵液和菌丝体挥发性物质。[结果]内生真菌GRE9发酵液及菌丝体既含有与宿主植物相同的挥发性成分，也含有特异性挥发性物质。[结论]甘草内生真菌GRE9是具有应用前景的内生菌。

关键词 内生真菌;挥发性成分;GC-MS

中图分类号 R284文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）17-0198-03

Abstract [Objective]The research aimed to compare the correlation between the endophytic fungi GRE9 and  the volatile components of the host plant Glycyrrhiza uralensis.[Method]The volatile compounds of GRE9 strains fermented broth and its mycelium were analyzed by GCMS.[Result]The volatile components in the GRE9 fermented broth and its mycelium not only contained the same volatile components with the host crude drugs，but also contained the specific volatile substances. [Conclusion] GRE9 strain is a Glycyrrhiza uralensis endophytic fungus which has wild application prospect in future.

Key words Endophytic fungus;Volatile compounds;GCMS

研究表明，微生物在生长发育过程中能产生多种挥发性物质[1]，这些挥发性物质能够刺激周围植物的生长、促进其次生代谢产物的积累[2]，诱导植物产生抗病能力，同时也在生物防治、物种通讯中起着重要的作用[3]。研究植物内生菌所产生的挥发性成分对于研究宿主植物与内生菌之间的关系及内生菌次生代谢物的动态积累具有重要的意义。

乌拉尔甘草（Glycrrhiza uralensis Fisch）为北方濒危药用植物[4]，具有抗病毒[5]、抗炎[6]、抗肿瘤[7]等多种活性作用，是临床常用大宗中草药之一。栽培种植虽然是解决甘草紧缺的替代方法[8]，但其采收期为2～3年，种植企业及农户资金回笼较慢。内生菌由于参与宿主植物体内成分的生物转化、诱导药用植物次生代谢产物的产生[9]，因此作为研究目标，利用微生物发酵法生产濒危药用植物的活性成分，减少药用植物资源的使用。笔者以甘草内生真菌GRE9为研究对象，对其挥发性成分进行分析检测，考察甘草内生真菌挥发性成分与甘草挥发性成分的相关性，为深入研究甘草内生真菌挥发性成分奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养

供试菌：内生真菌GRE9，黑龙江大学生物制药专业实验分离得到。PDB培养基：同参考文献[10]。

1.2 仪器与试剂

GC-MS联用仪（7890AGC-240MS，美国安捷伦公司）。试剂均为分析纯。

1.3 供试品溶液的制备

将GRE9活化，活化后接种于60 mL PDB培养基中（搖床培养条件：28 ℃，140 r/min，3 d），制成1×10 7CFU/mL种子培养液。以5%（V/V）种子液转接至300 mL PDB中按上述摇床培养条件培养14 d，抽滤，分别得到GRE9的发酵液及菌丝体。

1.3.1 内生真菌GRE9发酵液供试品的制备。

取“1.3”项下的发酵液，以乙酸乙酯萃取3次（3×100 mL），合并萃取液，50 ℃低温浓缩至干，以10 mL乙酸乙酯溶解，制得发酵液供试品，备用。

1.3.2 内生真菌GRE9菌丝体供试品的制备。

取“1.3”项下的菌丝体20 g，超声破碎后，以乙酸乙酯萃取3次（3×100 mL），随后同“1.3.1”，制得菌丝体供试品，备用。

1.3.3 对照药材供试品溶液的制备。

称取甘草生药粉末10 g，加入乙酸乙酯100 mL，超声提取1 h，过滤，取滤液，将滤液于50 ℃条件下减压浓缩至10 mL，得对照药材供试品溶液，冷藏备用。

1.3.4 空白对照品的制备。

取灭菌后的PDB培养基600 mL，抽滤，50 ℃低温浓缩至100 mL，乙酸乙酯萃取3次（3×100 mL），随后同“1.3.1”，制得培养基空白对照品，冷藏备用。

1.4 GC-MS分析条件

1.4.1 GC条件。Rtx-5ms毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;升温程序：在60 ℃条件下保持6 min，随后，以10 ℃/min 的速率升高至160 ℃，此温度条件下保持5 min，再以20 ℃/min的速率升高至240 ℃，此温度条件下保持10 min;进样温度为250 ℃;载气（He）流速为1 mL/min;压力设置为57.4 kPa;分流比（30∶1）;进样量精确至1 μL。

1.4.2 MS条件。电子轰击（EI）离子源;该条件下设置离子源温度230 ℃;接口温度250 ℃;溶剂延迟2.5 min;数据采集方式Scan;质量扫描范围m/z 40～450;检测器增益电压1.18 kV。

1.5 试验方法

采用GC-MS对GRE9菌株挥发性成分进行研究，通过质谱数据库（NIST Chemical Structures库）检索确定各样品中的化学成分，并采用面积归一化法确定各种化学成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 内生真菌GRE9发酵液挥发性成分分析

通过GC-MS分析，GRE9菌株发酵液中挥发性成分有13个峰，结果如图1所示。GRE9发酵液挥发性成分通过质谱数据库检索，确定了13个峰，结果见表1。

2.2 内生真菌GRE9菌丝体挥发性成分分析

采用GC-MS分析，在GRE9菌株菌丝体的挥发性成分中发现并确定了7个峰，其结果如图2，且这7个峰通过质谱数据库检索，分别得到了确认，其具体物质名称及相对含量见表2。

2.3 对照品药材挥发性成分分析

通过GC-MS分析甘草生药供试品的挥发性成分，发现并确定了12个峰，其结果如图3，甘草生药样品挥发性成分通过质谱数据库检索，分别确认了12个峰的具体物质名称及其相对含量，结果如表3所示。

2.4 空白对照品中挥发性成分分析 通过GC-MS分析空白PDB培养基样品的挥发性成分，发现并确定了3个峰，其结果如图4所示，这3个峰通过质谱数据库检索，分别确认其具体物质名称及其相对含量，结果见表4。

对比图1～4，分析表1～4，发现有2种化合物（邻苯二甲酸异丁酯和邻苯二甲酸二丙戊酯）为4种供试品所共有，甘草内生真菌GRE9发酵液中有8种特有成分;菌丝体中含有5种特有成分;甘草生药含有8种特有成分。对比甘草内生真菌GRE9发酵液与甘草生药供试品检测结果发现，二者相同的成分为十六烷酸和十八烷酸，而其余成分均具有差异性。

3 结论

甘草内生菌GRE9发酵液中存在与宿主植物甘草相同的挥发性成分，表明甘草内生菌GRE9与甘草可能具有相同的代谢机制;同时，甘草内生真菌GRE9所含有的特异性挥发性成分，说明内生真菌GRE9虽然分离自甘草茎部，但具有菌株生长特异性，更证实该菌具有一定的研究价值，为进一步研究和综合利用GRE9菌株奠定基础。

参考文献

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