基于离子液体双水相萃取番茄中抗氧化酶研究

李梦瑶　王书雅　谢云峰　黄蔚霞　翟晨　刘云国

摘要 基于 [C4mim] Cl/K2HPO4双水相体系，建立了萃取分离番茄中5种抗氧化酶（CAT、POD、SOD、AAO、PPO）的新方法。以番茄中抗氧化酶的活性为指标，研究了不同种类的离子液体和用量、K2HPO4的用量、体系pH及萃取时间等参数对番茄中抗氧化酶活性的影响，并与传统的缓冲溶液法提取效果进行比较。结果表明：当K2HPO4浓度为0.16 g/mL，[C4mim] Cl浓度为0.40 g/mL，pH为7.5，30 ℃ 200 r/min提取20 min时，提取的5种抗氧化酶活性比缓冲溶液法提取的酶活性高、稳定性好且萃取时间缩短了10 min。该提取方法操作简单，且实现多种酶的同时、快速、高活性提取，为植物性农产品的多酶快速提取提供了一种新的思路。

关键词 离子液体;双水相;抗氧化酶;萃取;酶活性

中图分类号 TS201.2文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）17-0179-03

Abstract Based on the aqueous twophase system formed by ionic liquid chloro1butyl3methylimidazolium [C4mim]Cl and K2HPO4， a new method for extraction of five antioxidant enzymes（CAT， POD， SOD， AAO， PPO） from tomato was established. Taking the activity of antioxidant enzymes in tomato as the index， the effects of different kinds of ionic liquids， the amount of K2HPO4， the pH and the extraction time on the activities of antioxidant enzymes in tomato were studied. The results showed that the optimal condition was： K2HPO4 concentration was 0.16 g/mL， [C4mim] Cl concentration was 0.40 g/mL， pH 7.5， 30 ℃ 200 r/min for 20 min， time reduced by 10 min. The extraction method was simple in operation， and realized simultaneous， rapid and highactivity extraction of various enzymes， which provided a new idea for rapid extraction of multienzymes in plant agricultural products.

Key words Ionic liquid;Aqueous twophase;Antioxidant enzyme;Extraction;Enzyme activity

番茄（Lycopersicon esculentum）属茄科茄属，为草本植物，其含有丰富的营养物质，用途广泛（生食、菜用及各种加工制品），是我国的主栽蔬菜[1]。番茄等果蔬采摘后，在后熟到衰老的过程中，其机体内的活性氧和酶保护系统随着果蔬的代谢活动而发生变化[2-4]。其在贮藏运输的过程中，由于呼吸代谢作用导致氧自由基含量、丙二醛（MDA）含量增加，激发抗氧化酶（过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、抗坏血酸氧化酶（AAO））等保护系统消除活性氧自由基等有害物质，从而可以避免造成组织损伤、细胞衰老或死亡，同时延长果蔬的贮藏期[4]。果蔬体内抗氧化酶活性高低可以作为判定果实品质劣变程度、贮藏货架期以及成熟衰老的标志[4-6]。目前，提取植物性农产品抗氧化酶更多依赖于传统的缓冲溶液法，该方法耗时长、提取酶活性低、稳定性较差。

离子液体（ionic liquid，ILs），作为一种新型的绿色溶剂，因具有不挥发、溶解性强等多种独特的性质，目前在分离萃取等领域表现出良好的应用前景[7]。离子液体雙水相体系是由亲水性离子液体和无机盐组成的两相[8]。离子液体双水相蒸气压极低，与有机溶剂萃取法相比不会因挥发而引发环境污染和威胁操作者健康等问题，体系的萃取分离条件温和，能使绝大部分生物分子保持活性同时具备分相快、不易乳化、离子液体可循环使用等特性，是近年来出现的一种极有前途的新型分离技术[9-10]。目前，离子液体及离子液体双水相体系被广泛应用于萃取分离重金属离子[11-12]、生物活性物质[13-15]、蛋白质[16-18]、酶[19-21]等。基于离子液体双水相体系，陈静等[20]成功地萃取了胰蛋白酶，并对其萃取机理进行研究;曾颖等[21]萃取木瓜蛋白酶，并证明能保持较高的酶活力。目前，采用离子液体双水相提取法对植物源农产品中多种酶的同时、快速、高活性提取的研究较少。

笔者以亲水性离子液体氯代1-丁基-3-甲基咪唑[C4mim] Cl和K2HPO4形成的双水相体系对番茄中的抗氧化酶进行萃取研究，以抗氧化酶的活性为指标，考察了离子液体种类及浓度、萃取时间、无机盐用量、体系pH、静置时间对番茄中抗氧化酶活性的影响，并与传统提取法相比较，提出了一种基于离子液体双水相体系，实现多种抗氧化酶同时、快速、高效、高活性的萃取分离方法。

1 材料与方法

1.1 材料

过氧化氢酶（2 000 U/mg）购自上海士锋生物科技有限公司;磷酸氢二钾（K2HPO4）、磷酸二氢钠（NaH2PO4）、30%过氧化氢H2O2、磷酸氢二钠（Na2HPO4）均为分析纯，购自北京化工厂;氯代1-丁基-3-甲基咪唑（[C4mim]Cl），氯代1-乙基-3-甲基咪唑（[C2mim]Cl），四氟硼酸1-丁基-3-甲基咪唑（ [C4mim]PF4）均为分析纯，购自上海爱纯生物有限公司。

1.2 仪器

Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore公司）;涡旋混匀器（德国IKA公司）;紫外可见分光光度计（日本Hitachi公司）;恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）;PB-10型pH计（德国Sartorius公司）;离心机（德国Eppendorf公司）;Synergy Mx酶标仪（美国 Bio-Tek公司）。

1.3 方法

1.3.1 离子液体双水相萃取抗氧化酶。

准确称取一定量的离子液体和K2HPO4，加入到10 mL刻度比色管中，加水溶解，溶解完全观察到体系分为上下两相（图1），上相富集离子液体，下相富集K2HPO4。用不同pH的缓冲溶液调节体系的酸碱度[22]，加入0.5 g研磨成浆的番茄泥，番茄位于两相中间（图2），于30 ℃、200 r/min恒温培养箱中振荡一定时间后静置，取上清液进行酶活性测定。

1.3.2 缓冲液法萃取分离抗氧化酶。

参考文献[23]，基于缓冲溶液法对5种抗氧化酶进行提取：取新鲜的番茄，洗净晾干，于搅拌机中打碎10 min，再冰浴状态下用研钵研磨至泥状。分别配制pH 7.8的50 mmol/L PBS，缓冲溶液提取CAT、SOD、POD三种抗氧化酶和pH 6.0的50 mmol/L PBS缓冲液提取AAO、PPO两种抗氧化酶，取4.5 mL酶提取液加入0.5 g研磨成浆的番茄泥，在4 ℃高速离心机中以 5 000 r/min的转速离心30 min，取上清液放入4 ℃环境中待用。

1.3.3 抗氧化酶活性测定。

过氧化氢酶（CAT）活性测定：通过测定1 min内H2O2在240 nm波长下消耗量，可计算得CAT活性[24];抗坏血酸氧化酶（AAO）活性测定：通过测定AsA的氧化量，可计算得AAO活性;多酚氧化酶（PPO）活性测定：PPO 能够催化邻苯二酚产生醌，后者在 410 nm 有特征光吸收[23];过氧化物酶（POD）活性测定：采用愈创木酚法测定[25];超氧化物歧化酶（SOD）活性测定：采用核黄素（NBT）法测定[26]。

2 结果与分析

2.1 萃取参数优化

2.1.1 离子液体种类和用量的选择。

研究以CAT活性为考察指标，对提取条件进行优化。将[C4mim]Cl、[C2mim]Cl及[C4mim]PF4与K2HPO4制备成相同浓度的双水相体系，分别加入相同浓度的酶溶液进行提取，通过检测酶活性考察不同离子液体的提取效果。由图3可知，[C4mim]Cl双水相提取的酶活性最高，其次为[C2mim]Cl，[C4mim]PF4提取效果最差，因此选择[C4mim]Cl作为双水相体系中的离子液体。

制备浓度为0.26～0.47 g/mL的[C4mim]Cl离子液体双水相体系，固定体系pH、提取时间以及K2HPO4的加入量，对离子液体的用量进行考察。由图4可知，在较低浓度时，酶的提取效果较差，随离子液体浓度的提高，酶活性逐渐升高，当浓度达0.40 g/mL时，提取效果最好，之后随着离子液体浓度升高，酶活性逐渐降低，因此离子液体浓度应控制在0.40 g/mL。

2.1.2 K2HPO4加入量的选择。

随着盐量的增加，上下相体积比逐渐减小，盐浓度过高或者过低，均不能形成双水相。由此可知，无机盐是双水相体系成相的主要原因之一，控制盐浓度为0.10～0.24 g/mL，保持pH不变，对CAT活性进行测试。由图5可知，随着盐浓度的增大，提取效果逐渐提高，在0.16 g/mL时达到最大。随着无机盐浓度增大，盐析作用加强，酶更趋向于分配上相，但过多的盐导致酶的活性下降，因此，盐浓度最优值为0.16 g/mL。

2.1.3 双水相体系pH的确定。

配制pH为6.5～9.5的离子液体双水相体系，考察体系中不同pH条件对酶活性的影响。由图6可知，在离子液体溶液双水相体系中，当pH<7.5和pH>7.5 时，酶活性均较低，在酸性或碱性条件下接近酶的等电点导致溶解性变差，部分析出致使酶活性下降。故试验中为保持酶的活性，双水相体系的pH应保持在7.5左右。

2.1.4 萃取和静置时间的确定。

准确称取0.5 g番茄泥于制备好的离子液体双水相体系中，充分混合均匀后，置于30 ℃、200 r/min的恒温培养箱中提取CAT，通过考察不同萃取时间和静置时间对提取的酶活性差异，确定最佳的萃取时间和静置时间。由图7可知，随萃取时间增加，酶活性逐渐增加，當萃取时间达20 min后，酶活性逐渐稳定，因此萃取时间选择为20 min。

在确定萃取时间的条件下，考察不同静置时间下提取的CAT活性的差异。由图7可知，酶活性随着静置时间的增加而升高，并在15 min时达到最高，之后由于放置时间的延长部分酶失活，导致酶活性有所下降，故选取的静置时间为15 min。

2.2 离子液体双水相法与缓冲溶液提取法的对比

对传统的缓冲溶液提取法与离子液体双水相法进行对比。由表1可知，离子液体双水相萃取得到的CAT、SOD、AAO、PPO这4种抗氧化酶活性高于传统的缓冲溶液提取法。由于该研究以[C4mim] Cl/K2HPO4形成上相富集离子液体和下相富集无机盐的双水相体系，基于盐析作用蛋白质水溶液在高浓度的中性盐中会析出产生沉淀，得到的蛋白质一般不失活，一定条件下又可重新溶解，基于配位作用蛋白质上的氨基酸会和离子液体发生配位反应，从而大大增强了蛋白质在离子液体中的溶解度，使蛋白质富集在上相的离子液体中[9]。然而，离子液体双水相法提取的POD活性低于缓冲溶液提取方法，可能是由于离子液体双水相体系pH较高，导致了部分酶活性丧失，后期将继续对POD酶提取条件进行优化，但离子液体双水相法提取的POD其标准差小于传统方法得到的酶活性的标准差。总体来说，离子液体双水相萃取法优于传统的缓冲溶液提取方法，且得到的酶活性更加稳定，该方法受到的外界干扰更小。

3 结论

该研究基于[C4mim]Cl/K2HPO4双水相体系，建立了萃取分离番茄中5种抗氧化酶（CAT、POD、SOD、AAO、PPO）的新方法。以抗氧化酶活性为指标，对离子液体的种类及浓度、提取时间、无机盐的用量、体系pH、萃取时间等条件进行了优化，并与传统的缓冲溶液提取法相比较。结果表明提取番茄中抗氧化酶的最佳条件是采用浓度为0.40 g/mL[C4mim]Cl离子液体，K2HPO4浓度为0.16 g/mL，pH为7.5，萃取时间为20 min，静置时间为15 min。该研究建立的离子液体双水相提取方法成功提取了番茄中5种抗氧化酶，酶活性比传统提取方法高（除POD外），且稳定性较好，萃取时间缩短了10 min。该研究提出了一种基于离子液体双水相体系的快速、高效、高活性的抗氧化酶分离方法。

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