不同分子量抗骨质疏松驴骨肽的制备工艺

刘楚怡　樊雨梅　王长伟　梅娜娜　杜芬　王东亮

摘要 [目的]探索制备不同分子量驴骨肽的工艺，并通过细胞试验对其抗骨质疏松活性进行研究。[方法]以驴骨粉为原料，酶法制备不同分子量驴骨肽，通过单因素及响应面优化得到最佳酶解条件，并考察其对成骨细胞MG-63中碱性磷酸酶活性的影响，确定具有抗骨质疏松活性的不同分子量驴骨肽的制备方法。[结果]确定了平均分子量为3 315 Da和797 Da的驴骨肽的制备方法，可使成骨细胞的碱性磷酸酶活性分别增加9.84%和9.83%。[结论]该研究确定了小于3 kD和大于3 kD这2个分子量段中具有最佳抗骨质疏松活性的驴骨肽的制备方法。

关键词 驴骨肽;分子量;抗骨质疏松活性;细胞试验

中图分类号 TS218文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）17-0155-04

Abstract [Objective]To explore the preparation of different molecular weight donkey bone peptides and to study antiosteoporosis activities by cell experiments. [Method]The donkey bone powder was used as raw material to prepare donkey bone peptides with different molecular weight. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were optimized by single factor and response surface， and the effect on alkaline phosphatase activity of osteoblast MG63 was determined. To study the method for preparing different molecular weight donkey bone peptides against osteoporosis activity. [Result]Through the present study， the preparation methods of two molecular weight donkey bone peptides with average molecular weights of 3 315 Da and 797 Da were determined， and the alkaline phosphatase activities of osteoblasts were increased by 9.84% and 9.83%， respectively. [Conclusion]This study identified a method for the preparation of donkey bone peptides with optimal antiosteoporosis activity in two molecular weight segments less than 3 kD and greater than 3 kD.

Key words Donkey bone peptide;Molecular weight;Antiosteoporosis activity;Cell experiment

驴在我国具有悠久的飼养历史，资源丰富。以驴皮为基本原料制作的阿胶，具有滋阴养血、补肺润燥、止血安胎的疗效，是久负盛誉的滋补药[1]。然而，除驴皮外，驴血、驴骨、胎盘等加工副产物中也有很高的营养价值及应用价值[2]。驴骨中蕴含大量宝贵的营养资源，如驴骨胶原及其肽类、硫酸软骨素等具有独特生物活性的物质[3]，可用于食品、化妆品生产中，具有很高的开发利用价值[4]。但目前，驴骨大多以骨粉等粗加工形式被少量利用，其余大多数都被废弃并导致严重的环境污染。开发一种安全高效的从驴骨中制备活性驴骨肽的方法成了亟待解决的问题。

肽类化合物广泛存在于自然界中，是指一类通过肽键连接氨基酸而成的化合物，它是机体组织细胞的基本组成成分。肽类特别是一些低聚肽，不仅具有比蛋白质更好的消化吸收性能，而且还具有调节人体生理机能等作用。生物活性肽就是指一类介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物[5]，具有增强机体防御功能、调节生命节律、预防疾病和促进康复等多种生物学功能[6]。近年来，已经发现了一些具有改善骨质疏松活性的肽，如鱼骨胶原肽、龟鹿胶肽等，具有能够增加骨密度、促进成骨细胞增殖及相关酶分泌[7-8]、改善骨质疏松的活性。

骨质疏松症是一种全身性的骨代谢疾病，具有骨量减少、骨组织微结构退化、骨脆性增加等特征，常表现为患者骨密度下降、腰背疼痛、骨折等症状[9]。骨质疏松症发病率逐年升高，目前全世界约有2亿人患骨质疏松症，骨质疏松症已被公认为是仅次于心血管疾病的第二大健康杀手，已成为极为严重的公共健康问题[10]。

目前，国内关于从驴骨中制备具有抗骨质疏松活性的驴骨肽的研究鲜见报道，利用酶法开发具有生物活性的驴骨肽具有重要的理论意义和应用价值。笔者以驴骨粉为原料，酶法制备大于3 kD和小于3 kD这2种分子量的驴骨肽，并考察其对成骨细胞MG-63中碱性磷酸酶活性的影响，确定具有抗骨质疏松活性的不同分子量驴骨肽的制备方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

驴骨粉，东阿阿胶股份有限公司;胰蛋白酶（10 000 U/g），南宁庞博生物工程有限公司;成骨细胞MG-63：武汉普诺赛生物科技有限公司;无水乙醇（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、三氯乙酸（分析纯）、三氟乙酸（分析纯）、硫化钠（分析纯）、乙腈（色谱纯），北京化学试剂公司;3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、牛血清蛋白、维生素B12、谷胱甘肽及胶原蛋白，Sigma公司;Giemsa液，索莱宝公司。

Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent 1100型氨基酸自动分析仪，美国安捷伦公司;MSM2013实验室用膜分离设备，上海摩速科学器材有限公司;UV-2010PC紫外可见分光光度计，尤尼克（上海）仪器有限公司;VersaMax Tunable Microplate Reader光栅式恒温酶标仪，VersaMax Tunable公司;BX43荧光显微镜，Olympus公司。

1.2 酶解最适蛋白酶的筛选

选择木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶等蛋白酶，分别在最适工艺条件下进行驴骨粉酶解试验。酶解结束后，95 ℃灭酶。茚三酮法分别测定每一反应水解度，利用南京建成生物工程研究所的碱性磷酸酶试剂盒检测细胞中碱性磷酸酶（AKP）活力。以水解度大小和AKP活力为指标，确定每种蛋白酶的酶解能力，筛选最适蛋白酶。

1.3 驴骨粉酶解条件优化

通过单因素试验对驴骨粉酶解的pH、温度、底物浓度和加酶量等条件进行优化。将驴骨粉加入蒸馏水配成不同浓度的驴骨粉溶液，用NaOH溶液分别调节到指定pH，按照一定加酶量分别加入胰酶，在指定温度水浴中酶解3 h后，95 ℃灭酶，茚三酮法分别测定每一反应水解度，重复3次，结果取平均值。经过酶的筛选，温度、加酶量和pH的单因素条件筛选，并在单因素研究的基础上，确定响应面优化的条件。通过响应面分析最后获得酶解最优条件，并对最优酶解条件下的酶解产物及胶原肽分别进行高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测。

1.4 成骨细胞MG-63的复苏培养及传代

达尔伯克（氏）必需基本培养基（DMEM）按照100单位/mL加入青霉素、链霉素，过滤除菌。0.25%胰蛋白酶：称取0.25 g胰蛋白酶溶于100 mL PBS中，4 ℃过夜后使用0.22 μm微孔濾膜过滤除菌，分装后冷藏于-20 ℃。

细胞培养：以DMEM完全培养基调整细胞密度为2×10 5个/mL的细胞悬液，接种于6孔板，每孔体积2 mL，置于37 ℃、5%的CO2培养箱内培养。贴壁24 h后弃培养液，分别加入含各种驴骨胶原肽的完全培养液。每组设置3个复孔，在37 ℃、5%的饱和湿度培养箱中连续培养5 d，每2 d换液一次。

1.5 分子量分布的测定

使用TSK GEL G2000SWXL色谱柱，通过高效液相色谱测定驴骨肽的分子量分布。检测条件为以体积比1∶1的乙腈与0.2%三氟乙酸混合溶液为流动相，按0.5 mL/min的流速过柱，紫外检测波长为225 nm。取牛血清蛋白、维生素B12、谷胱甘肽及胶原蛋白样品各1 mg，分别溶于1 mL的纯水中，用0.45 μm微孔滤膜过滤后进样。结果通过GPC软件进行分析。

1.6 驴骨肽基本组成的测定

对驴骨肽的基本理化性质进行检测，包括蛋白质含量、糖原含量、脂肪含量、水分以及灰分。采用的具体方法如下：蛋白含量的测定按照凯氏定氮法，根据国标GB/T 5009.5—2016测定;糖原含量的测定按照蒽酮比色法，根据GB/T 9695.31—2008测定;脂肪根据国标GB/T 5009.6—2016测定;水分根据国标GB 5009.3—2016测定;灰分根据国标GB5009.4—2016测定。

1.7 碱性磷酸酶（AKP）活性的测定

碱性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活性的高低。按照南京建成生物工程研究所的碱性磷酸酶试剂盒说明书方法进行检测。

AKP活性增长率=（添加肽后细胞AKP活性-未加肽前细胞AKP活性）/未加肽前细胞AKP活性×100%

1.8 数据统计

采用SPSS软件和Design expert软件进行数据统计和方差分析。

2 结果与分析

2.1 酶解最适酶的筛选

使用7种蛋白酶在各自特定的最佳酶促水解条件下进行蛋白的酶促水解。由图1可知，随着酶解时间的增加，水解度逐渐增加，但水解度的增加趋势逐渐减缓。当水解时间高于120 min时，胰酶和风味蛋白酶酶解效果显著优于其他酶，其中风味蛋白酶水解度最高。

由图2可知，7种蛋白酶在各自特定的最佳酶促水解条件下水解3 h后，除胃蛋白酶外，AKP酶活力均显著高于未酶解的驴骨胶原。并且，AKP酶活由高到低的顺序依次为胰酶水解物、风味蛋白酶水解物、中性蛋白酶水解物、碱性蛋白酶水解物、木瓜蛋白酶水解物、菠萝蛋白酶水解物、胃蛋白酶水解物，AKP酶活最高的水解物为胰酶水解物。选用胰酶和风味蛋白酶进行单因素条件优化。

2.2 酶解条件优化

通过单因素试验选择胰酶和风味蛋白酶酶解驴骨胶原的条件，分别考察pH、底物浓度、温度和加酶量对酶解程度的影响（图3）。

通过以上单因素试验可以看出，在单因素的基础上，采用Design-Expert8.0.5中的Box-Behnken中心组合进行3因素3水平设计响应面试验，以pH（A）、温度（B）和底物浓度（C）为变量，其中pH选择7、8、9，底物浓度选择20、30和40 mg/mL，温度选择40、45、50 ℃，中心点重复5次共17个处理得到如下设计方案及结果。17个处理条件及结果如表1所示。

方差分析结果表明，该数学模型F值为4.10（P=0.038 2<0.05），达到了显著水平，说明该方程的试验点与结果相吻合，而失拟性检验F值为1.55（P=0.333 0>0.05），差异不显著，表明方程没有失拟因素，回归方程的拟合较好，模型能够反映真实的情况。

采用Design-Expert8.0.5统计分析软件进行回归优化得到AKP增长率模型为：

AKP增长率（%）=8.58-0.055A-1.08B-0.19C-0.018AB-0.57AC+0.33BC+0.24A 2-1.26B 2-1.22C 2

图4分别表示的是pH-温度、pH-底物浓度、温度-底物浓度对驴骨胶原蛋白水解物AKP增长率的影响。从各因素的分析可知，3个自变量（温度、pH、底物浓度）均对AKP增长率有不同程度的影响。3个反应条件对AKP增长率的影响程度大小排序为提取pH、底物浓度、温度。“Prob > F”<0.05说明是模型中的显著因素。分别对各因素相互作用对AKP增长率的影响进行试验，得出试验方案的最佳条件。以成骨样细胞MG-63中AKP的分泌量为考察指标，驴骨胶原蛋白酶解的最优条件为将胰酶按照4 000 U/g加酶量加入25.4 mg/mL底物中，调节pH至7.62，在48.03 ℃反应240 min，水解度为22.25%，AKP增长率为8.92%。采用优选出来的最佳条件进行试验验证，得到的实际平均水解度为22.45%，AKP增长率为9.03%。实际试验与理论值相差较小，因此Box-Behnken Design-响应面优化驴骨胶酶解条件的优化试验可行，模型设计合理。

2.3 酶解时间对驴骨肽分子量及AKP增长率的影响 在前述得到的最佳酶解条件下，酶解不同时间，得到不同的酶解物，分析各产物对成骨样细胞MG-63中AKP分泌量的影响及平均分子量。通过HPLC分析酶解产物，并通过GPC软件分析对应酶解产物的相对分子质量分布（表2）。发现加入2 000 U/g胰酶，酶解10 min的酶解产物，AKP增长率为9.84%，平均分子量为3 315 Da;加入2 000 U/g胰酶，酶解20～45 min，平均分子量为1 000～3 000 Da，其中AKP增长率最高的为酶解30 min时，AKP增长率为9.19%。

2.4 驴骨肽基本组成分析

按照国标方法分别对按照以上工艺制备的2种驴骨肽及驴骨粉的基本组成进行分析，其基本组成如表3所示。经过以上工艺，驴骨肽中的蛋白含量从驴骨粉中的57.3% 增加到了87.6%和91.9%。在驴骨肽加工过程中，灰分也有了大幅降低，分别降低至1.4%和1.1%。另外，脂肪含量从10.5%降低到了6.2%和4.2%。在驴骨肽产品中，还存在部分未除去的脂肪及碳水化合物等物质，这是因为在以上工艺过程中为了防止引入其他化学物质增加其安全风险，并未进行脱脂步骤，这可以避免在驴骨肽制备过程中引入有害物质。

3 结论

该研究得到具有最佳抗骨质疏松活性的2种分子量的驴骨肽制备工艺，制备得到的大于3 kD驴骨肽粉平均分子量为3 315 Da，蛋白含量为91.9%，可使成骨细胞的碱性磷酸酶活性增加9.84%;小于3 kD驢骨肽粉平均分子量为797 Da，蛋白含量为87.6%，可使成骨细胞的碱性磷酸酶活性增加9.83%。

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