PGPR菌剂对植烟土壤微生物群落结构的影响

冯文龙　辜运富　余伟　闫芳芳　张映杰　张宗锦　罗富国　白加林　周欢

摘要 采用PCR-DGGE技术对烟草土壤中细菌群落结构进行分析，对其中10条优势条带进行切胶回收、克隆测序及系统发育分析。DGGE图谱结果显示，施用多功能菌剂后细菌群落结构多样性比未施用多功能菌剂高。在采用多功能菌剂的前提下，减少化肥的施用量不会对烤烟的农艺性状和理化性质造成不良影响，T3处理（减肥10%）对土壤和烤烟的影响最明显。典范对应分析（canonical correspondence analysis，CCA）显示，pH、全氮和有效磷是造成烤烟土壤微生物群落结构变化的主要因素。

关键词 PGPR菌剂;植烟土壤;DGGE;群落结构

中图分类号 S154.3文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）17-0146-05

Abstract PCRDGGE （polymerase chain reactiondenaturing gradient gel electrophoresis） technology was employed to analyze the composition of bacterial community in selective different soil samples.The recovery，cloning，sequencing and phylogenetic analysis of 10 dominant bands were performed.The results of the DGGE showed that there was a difference in the diversity of bacteria between the soil samples with and without PGPR.Under the premise of use of microbial inoculants，reducing the use of fertilizers would not adverse effects on the agronomic traits and physicochemical properties of fluecured tobacco.T3 treatment was most obvious impact on the soil and fluecured tobacco.The canonical correspondence analysis （CCA） showed  that soil pH，TN and AP were the critical factors to shape the bacterial community structure in tobaccogrowing soil.

Key words PGPR bactericide;Tobaccogrowing soil;DGGE;Community structure

我国烟叶长年规模种植，导致土壤质量持续下降，严重制约了烟叶品质的提高，寻求新型肥料来替代或者部分替代化肥的研究备受关注，最常见的替代传统化肥的方法之一是施用微生物肥料和有机肥[1-2]。笔者以“促生抗病”为原则，根据2018年在攀枝花烟区开展的PGPR菌制田间筛选结果，应用最佳菌剂组合，同时开展烤烟“减施增效”试验，探索在烟区增施多功能微生物菌剂，以减少化学肥料施用，保证烤烟品质，进一步评价菌剂在改善烤烟土壤质量、促进烤烟生长、提升烤烟品质方面的效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

①酒糟有机肥：有机质含量≥45%，氮+磷+钾≥5%，pH 5.5～8.5;②烤烟复合肥：总养分含量≥55%，其中N、P2O5和K2O組成为10∶0∶44;硫酸钾中K2O≥50%;③多功能菌剂：由3株细菌组成，即CN42（Streptomycete sp.）、P29（Streptomycete sp.）、P60（Streptomycete sp.），分别接种于高氏一号液体培养基，28 ℃下培养，菌液OD600达1.0后，按0.5%的比例接种于装有500 g麦粒并经灭菌处理的玻璃瓶中进行扩大繁殖，培养15 d，待菌种长满整个麦粒瓶后取出，用清水稀释成含活菌浓度约1×10 7/mL的溶液，将3种菌液按1∶1∶1的比例混合，进行灌根处理。

1.2 试验设计

在攀枝花米易烟区开展。土壤pH 6.25，有机质12.96 g/kg，全氮1.47 g/kg，碱解氮124.63 mg/kg，速效钾137.94 mg/kg，有效磷9.69 mg/kg。在田间采取随机区组排列，5个处理，每个处理3个重复小区，共15个小区。

T1：有机肥（酒糟）+复合肥;

T2：有机肥（酒糟）+多功能菌剂（100PRA）+复合肥（100%）;

T3：有机肥（酒糟）+多功能菌剂（100PRA）+复合肥（90%）;

T4：有机肥（酒糟）+多功能菌剂（100PRA）+复合肥（80%）;

T5：有机肥（酒糟）+多功能菌剂（100PRA）+复合肥（70%）。

1.3 土样采集与预处理

土样采用“梅花桩”型原则，按照4分法将土样进行混匀，土样混匀后取1 kg用无菌PET树脂袋封装，放于冰盒中带回实验室。将土样于-20 ℃下保存备用，取部分土样进行土壤理化的测定。

1.4 烤烟产量、产值测定

按照《中华人民共和国烟草行业标准YC/T 142—1998烟草农艺性状调查方法》和GB2635—92烤烟标准，测定烤烟收获后经济和品质性质，测定指标为产量、产值。

1.5 土壤理化性质测定

按照鲁如坤[3]土壤农业化学分析办法进行测定。采用CANOCO4.5.1軟件（Microcomputer Power，Ithaca，USA）分析土壤理化指标和细菌群落结构之间的关系。

1.6 样品总DNA的提取

称取土壤样品0.5 g，采用Fast DNA Spin Kit for Soil（Qbiogene，Carlsbad，CA，USA）的试剂盒方法，土壤微生物总DNA的提取按照试剂盒上的步骤进行。

1.7 16S rRNA片段的PCR扩增

第一轮PCR扩增采用引物：BSF8（5′-AGAGTTTCCTGGCTCAG-3′）和BSR1514（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）[4]。PCR反应体系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL （TIANGEN），2种引物各0.5 μL （10 μmol/L），0.5 μL模板DNA （10 ng/μL），加ddH2O补齐至50 μL。反应程序：95 ℃预变性 5 min， 94 ℃变性 1 min， 65～55 ℃退火 50 s， 72 ℃延伸90 s，共 20 个循环（每个循环温度降低 0.5 ℃），然后在预变性和变性条件不变的情况下，在 55 ℃的退火温度下扩增15个循环结束后，72 ℃延伸7 min，产物于4 ℃恒温保存。用1.0% 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物检测，后用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行纯化作为第二轮PCR的模板DNA。

第二轮PCR扩增引物：968f-GC（5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3′）[5]和P1401：（5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3′）[6]。PCR反应体系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL （TIANGEN），2种引物各0.5 μL （10 μmol/L），1 μL模板DNA （10 ng/μL），加ddH2O补齐至50 μL。反应程序：94 ℃预变性 5 min， 94 ℃变性 1 min， 63～53 ℃退火 50 s， 72 ℃延伸90 s，共 20 个循环（每个循环温度降低 0.5 ℃），然后在预变性和变性条件不变的情况下，在 53 ℃退火50 s扩增15个循环结束后，72 ℃延伸7 min，产物于4 ℃ 恒温保存。用1.0% 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物检测，后用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行纯化，产物于-20 ℃保存备用。

1.8 PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE） 采用变性剂梯度凝胶电泳（DGGE）的方法对25 μL纯化后的PCR产物进行分析，聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性剂为35%～65%。配制好高低浓度胶后分别加入50 μL 10%（W/V）过硫酸铵和25 μL TEMED，使用Bio-Rad 475型灌胶系统进行灌胶。待胶凝固后，每个点样孔加入25 μL PCR产物，每个样品设置3个重复共15个泳道。在1×TAE缓冲液中，50 V 预跑30 min，然后180 V、60 ℃恒温恒压电泳7.0 h。电泳完毕后硝酸银染色，然后拍照。

对土壤样品 DGGE 图谱借助于Bio-Rad公司的Quantity One 分析软件对电泳条带进行多样性分析。以多样性指数（H）、丰富度指数（S）、优势度指数（C）和均匀度指数（EH）等指标来评估富集培养中细菌的物种多样性[7-9]。

H=-（niN）ln（niN），EH=HlnS，C=-（niN 2）

式中，ni为单一条带的强度，N为所有条带的总强度，S是泳道中条带数目的总和[10]。

1.9 DGGE条带克隆和测序分析

对DGGE图谱条带中的优势条带和特异性条带进行切胶回收，用无菌去离子水反复冲洗3次，并用无菌枪头将条带挤碎，最后加入20 μL去离子水并置于4 ℃静置备用。以该溶液为模板，用第二轮PCR扩增不含GC夹子的P1401和P968-GC为引物，程序和体系与第二轮PCR相同，进行PCR扩增。用Clean-Up TM试剂盒（MO BIO Labs，Solana Beach，CA，USA）对PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物用pGEM-T Vector进行克隆，挑选阳性克隆子，同时进行菌液PCR检测。测序由上海生物工程技术有限公司完成，将测序结果去除载体序列，通过在NCBI数据库上进行BLAST比对，在GenBank获取的相似度较高的序列，用MEGA 5.0软件中的Kimura2Parameter Distance模型对获得的同源序列和测定序列进行序列匹配，然后采用 Neighborjoining（链接法）方法在Mega 5.0中进行系统发育分析[11]。

2 结果与分析

2.1 生物肥施用对烟叶产量和产值的影响

烟叶收获、烘烤完毕后，按照国标进行分级计产，各处理烟叶产量、产值和均价见表1。由表1可知，从产量来看，各施肥处理下产量均显著高于对照T1（T4>T2>T3>T5），与对照相比产量增加了5.93%～12.50%，其中T4和T2处理产量增高率>10%。相对于常规不减肥处理（T2），减肥处理下产量有增有减，T4处理下增长率大于T2，而其他2个处理均小于T2处理。从产值来看，各施肥处理下产值也均显著高于对照T1（T2>T4>T3>T5），与对照相比产值增加了7.01%～14.80%。相对于常规不减肥处理（T2），减肥处理下产量略少，但差异不显著。均以T3处理最高，T2处理次之，与对照T1处理均差异显著，且其余处理均高于T1处理。

2.2 土壤理化性质分析

由表2可知，5个土壤样品均为中性或弱酸性，相对于不施加多功能菌劑的处理（pH=5.43），施加多功能菌剂的土壤pH为6.09～6.74，显示施加多功能菌剂会使土壤pH增加，且随着复合肥用量的增加而增加，在减肥10%（T3）处理时达到最高。5个土样有机质含量为32.46～40.34 g/kg。相对于仅施用有机肥和复合肥的常规施肥制度土壤而言，有机肥和复合肥与多功能菌剂配施，会增加土壤碱解氮含量，且就不同减肥处理而言，在减肥10%（T3）处理时，土壤碱解氮含量最高。速效钾、有效磷、全氮都表现出此趋势。

2.3 土壤内细菌DGGE图谱分析

不同施肥制度下植烟土壤中细菌16S rRNA基因群落的DGGE图谱见图1。其中不同位置的条带代表不同的细菌种类，每个泳道中条带数越多表明细菌群落结构越复杂，条带强度越高表明该菌种属的丰度越高[12]。从DGGE图谱看，每个泳道均检测到数目不等的条带，电泳条带数量、强弱和位置均存在一定程度的差异，各样品中不仅存在共同的条带，还具有各自独有的优势条带。施用多功能菌剂（PGPR）影响土壤中细菌群落结构，且表明在施用多功能菌剂（PGPR）的基础上配合施用不同量的复合肥细菌群落结果表现出差异。

通过比较不同施肥处理下的DGGE条带，相对于不施用多功能菌剂仅施用有机肥和复合肥的常规土壤而言，施用多功能菌剂（PGPR）后出现一些独有的优势条带，表现出群落结构的差异。此外，通过比较在施用多功能菌剂（PGPR）的基础上，配以施用不同浓度复合肥的土壤后发现，土壤中细菌群落结构也表现得更为复杂。其中以T3处理下群落结构最为复杂。

2.4 土壤内细菌遗传多样性分析

根据DGGE图谱对样品中细菌群落丰富度（S）、多样性指数（H）、优势度（C）和均匀度（EH）进行计算，结果见表3。均匀度（EH）反映群落中不同物种多度分布的均匀程度，均匀度越接近1，表明其分布越均匀。多样性指数（H）用于描述种群的个体出现紊乱和确定性，不确定性越高，多样性越高。优势度指数（C）也可以在一定程度上反映样品的多样性。

施用PGPR菌剂后烟草土壤的细菌群落结构表现出一定的多样性，但土壤细菌群落结构的多样性和丰富度变化不明显。T3（减肥10%）下土壤细菌的丰富度、多样性指数最高，无多功能菌剂处理（T1）下丰富度、多样性指数最低。从5个处理的多样性来看，施用多功能菌剂后土壤中细菌群落结构多样性均高于未施加多功能菌剂的土壤（T1）。这说明多功能菌剂的施用对土壤中细菌群落结构的多样性具有一定影响。

2.5 基于DGGE图谱回收序列

15个样品DGGE电泳后，从图谱中成功回收了10条条带（图1）。对切割条带进行PCR扩增，纯化克隆后送上海生工生物工程有限公司测序。将测序结果与GenBank数据库中的序列进行Blast比对，找出同源性最高的序列。所有回收条带的序列与数据库中的模式菌株都具有一定的同源性，相似度在99%～100%。由表4可知，荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和嗜热假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）存在于5种不同施肥制度下的植烟土壤中。而有些是施加菌剂后新增的菌属，如约氏不动杆菌种（Acinetobacterjohnsonii）存在于常规不减肥（T2）处理和减肥10%（T3）配施的土壤样品中。沙福芽孢杆菌属（Bacillus safensis）存在于全量施用化肥处理（T2）、减肥10%处理土壤样品中。Methylobacteriumhispanicum仅存在于减肥30%（T5）处理的土壤样品中。表明不同处理下的土壤样品中存在特异性的细菌类群。

2.6 16S rRNA系统发育分析

在图2可知，10条序列分别归为苏云金杆菌属（Bacillus thuringiensis）、约氏不动杆菌种（Acinetobacter johnsonii）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、荧光假单孢菌（Pseudomonas fluorescens）、嗜热假单孢菌（Pseudomonas fluorescens）、沙福芽孢杆菌属（Bacillus safensis）、乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）、Kluyvera georgiana、Methylobacterium hispanicum。说明不同处理下烤烟土壤内细菌存在一定的多样性和丰富度。

2.7 土壤细菌种群和理化性质典范对应分析（CCA）相关分析

以种群重要值建立物种数据矩阵，以6个土壤理化性质指标建立环境数据矩阵，对不同处理下烤烟土壤细菌群落进行CCA排序，排序结果见表5和图3。CCA排序中第一和第二2个排序轴的特征值分别是0.291、0.242;细菌群落组成和土壤理化指标与前2个排序轴的关系系数分别为0.952、0.850。相关系数高，排序效果理想，能够反映不同处理下细菌群落分布特征。

在CCA排序图（图3）中，箭头连线的长度表示理化因子与群落相关程度的大小，长度越长，代表其对群落的分布影响越大;环境因子与排序轴之间的正负相关性由箭头所处的象限来表示;排序轴与箭头连线的夹角代表这个理化因子与排序轴的相关性大小，夹角越小，相关性越大。从排序图看，首先，6个理化因子的箭头连线均较长，表明他们与种群的相关程度很高。从理化性质箭头连线与排序轴夹角看，CCA第一排序轴主要由pH和全氮构成，且为负相关。而CCA第二排序列由有效磷、碱解氮、速效钾、有机质、全氮和pH构成，前5项排序轴正相关，pH与排序轴负相关。其中有效磷的箭头连线最长。表明pH、全氮和有效磷是影响群落分布的主要因子。

3 讨论

3.1 不同施肥处理对烟草农艺性状和土壤理化的影响

PGPR肥料在小麦、水稻和玉米等农作物及蔬菜上的应用效果良好[13]。该试验基于施用多功能菌剂的前提下，在烟草栽培中减少化肥的施用，会不同程度地影响烤烟烟叶化学品质，稳定烤烟的产量和产值，提高经济效益，与前人研究结果一致[14]。土壤有机质矿化的速度及各种养分存在的状态在一定程度上由土壤微生物种类、数量的变化及它们在土壤中的某些生物化学过程强度来反映。有效微生物群可加速土壤有机物转化，提高土壤速效养分含量[15]。微生物肥料的施用使土壤主要肥力要素含量有所提高[16]。该试验测定施用PGPR菌剂后烤烟土壤的pH、有机质、全氮、速效氮、速效磷和速效钾等理化指标。发现施用菌剂后烤烟土壤的各项理化指标均较CK处理下的烤烟土壤高，土壤性能得到改善。

3.2 不同施肥制度对植烟土壤群落结构的影响

DGGE图谱分析显示，施用多功能菌剂（PGPR菌剂）与未施用多功能菌剂的植烟根际土壤细菌多样性、群落结构存在差异，说明多功能菌剂影响细菌群落结构。此外，在伴施菌肥的前提下，减少一定化肥用量土壤细菌群落结构也存在差异。与该研究结果相似，Sang等[17]研究表明，在土壤中接种外源微生物对土壤微生物活性和微生物群落结构造成直接或间接的影响，从而影响土壤生态系统的功能发挥和结构稳定性。但在减肥处理下，减肥对土壤微生物群落结构和丰富度的影响不明显。

3.3 土壤环境因子对植烟土壤群落结构的影响

微生物群落结构往往受到土壤微生物环境改变的影响。CCA将环境因子作为约束条件考虑到排序分析中，分析环境因子对微生物群落结构的影响。研究认为烟草土壤中细菌与土壤pH、速效氮和速效磷等显著相关[18]。该研究CCA分析显示，pH、全氮和有效磷的影响高于其他影响因子，是造成烤烟土壤微生物群落结构变化的主要因素。与该研究结果相似，王佩文等[19]研究发现土壤pH是细菌群落多样性和丰度的关键影响因子。

该研究结果表明，由CN42（Streptomycete sp.）、P29（Streptomycete sp.）、P60（Streptomycete sp.）3株细菌组成的PGPR菌剂可以很大程度上提高烟叶品质和产量，同时减少化肥的使用。施用多功能菌剂对微生物群落结构造成影响，在减肥处理下，減肥对土壤微生物群落结构和丰富度影响不明显。pH、全氮和有效磷是造成烤烟土壤微生物群落结构变化的主要因素。这表明多功能菌剂PGPR在烤烟的减肥栽培上表现出明显促进效果，在烤烟栽培中的减施化肥方面具有潜在应用价值。

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