萌发期和苗期玉米转海藻糖合酶基因的抗旱性研究

2019-10-09董春林张彦琴杨丽莉梁改梅杨睿常建忠赵巧红张明义

安徽农业科学 2019年17期

董春林　张彦琴　杨丽莉　梁改梅　杨睿　常建忠　赵巧红　张明义

摘要在PEG溶液模拟干旱条件下，研究了不同玉米品种（2个转基因品系和各自受体对照）发芽率、伤害率、芽根比、叶片含水量、叶片SOD活性、POD活性和MDA含量，并对其在种子盒、花盆和田间的耐旱性进行了比较。结果表明，萌发期与苗期抗旱性表现基本一致，2个转基因品系（T09100-3和H5T37）分别比各自受体（综31和178）耐旱性高。

关键词转海藻糖合酶基因;玉米;抗旱性;PEG模拟干旱胁迫

中图分类号 S513 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）17-0028-04

Abstract Under the drought conditions simulated by PEG solution，we researched the germination rate，damage rate，shootroot ratio，leaf moisture content，leaf SOD activity，POD activity and MDA content of different maize varieties.And their drought tolerances in seed box，pot and field were compared.Results showed that the drought resistances at germination stage and seedling stage were basically the same.The two transgenic strains （T09100-3 and H5T37） showed greater drought tolerance than their own receptors （Zong 31 and 178）.

Key words Trehalose synthase gene;Maize;Drought resistence;The imitating drought stess of PEG

干旱是世界范围内影响农业生产的重要环境因子之一，它不仅影响植物的正常生长发育，造成农作物减产，而且还使生态环境日益恶化[1]。创制作物抗旱新种质、培育抗旱和耐旱新品种是当前作物品种改良的一个重要研究方向[2]。玉米种质资源和品种的抗旱性鉴定和评价是抗旱种质利用和品种改良的重要基础性研究。玉米是我国第一大粮食作物，需水较多且对水分胁迫较敏感，干旱是影响玉米产量的重要限制因素[3]。在利用转基因技术提高玉米抗旱性研究方面已有一些单位将海藻糖合酶基因在玉米上转化成功[4-5]，这在一定程度上丰富了玉米种质资源库，但对转海藻糖合酶基因玉米抗旱性的科学评价仍鲜见报道。鉴于此，笔者在PEG溶液模拟干旱条件下，研究了不同玉米品种（2个转基因品系和各自受体对照）发芽率、伤害率、芽根比、叶片含水量、叶片SOD活性、POD活性和MDA含量，并对其在种子盒、花盆和田间的耐旱性进行了比较。

1 材料与方法

1.1 试验材料供试材料由山西省农科院旱地农业研究中心种质资源室提供与创制（表1）。

1.2 试验方法

2016年4月，用15%PEG-6000（wv）做渗透介质，对供试材料做发芽试验;2016年5月5日将供试材料种植于花盆内，每盆10株，每品种各种6盆。盆体直径35 cm、高30 cm。出苗到第5片叶完全展开期间，植株供水适量而充足，并进行以下操作：①进行离体叶片保水力测定[6];②取盆内4个品种（转基因品系与其受体）的带根植株洗净，用0、15%、25%和35%聚乙二醇（PEG）Holland营养液500 mL浸泡（每品种5株），模拟干旱胁迫7 d，测SOD酶活性、POD酶活性与MDA酶活性，比较酶活性的变化规律，测试前准确称取0.1 g样品，按照重量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例，加入9倍体积的匀浆介质（pH 7.0的0.2 mol/L磷酸缓冲溶液），冰浴条件下制成10%的组织匀浆，3 500 r/min离心10 min后，取上清液测定;③剩余植株一半做对照继续适量供水，另一半停水7 d进行水分胁迫，观察植株的自然形态变化。2016年5月13日将供试材料分别在种子盒和大田播种种植，2个转基因品系分别与各自受体分左右播于同一种子盒，观察其出苗快慢、整齐度和苗期耐旱情况。

1.3 测定项目

用15%PEG-6000（wv）做渗透介质，在无光照的恒温箱内进行高渗溶液发芽试验，发芽温度为（25±1）℃，以水为对照[7]，计算转基因品系与其受体的伤害率：

伤害率= （水中发芽率-15%PEG溶液發芽率）/水中发芽率

发芽试验后，把每个供试材料水中与渗透介质中发过芽的种子用自来水冲洗干净，并吸干水分，剪成芽和根2部分，在80 ℃烘箱中烘干，分别测芽干重与根干重，由此求得各自芽根干重比。

离体叶片保水力测定采用称重法。在供水充足的植株上取3片叶静置相同环境下，每隔一定时段称重，计算离体叶片含水量（占自然鲜重的%）。

叶片含水量=Wf-WdWf×100

式中，Wf为叶片自然鲜重，Wd为叶片每个时段干重。

采用试剂盒法测定SOD酶活性、POD酶活性与MDA酶活性，取离心好的上清液按照试剂盒说明配液操作。

1.3.1 SOD酶活性测定。混匀后，3 500 r/min离心10 min，取上清于波长550 nm处，1 cm光径比色杯，双蒸水调0，测定各管的吸光度。计算公式为：

SOD活力=对照OD-测定OD0.5×对照OD×反应液总体积（mL）取样量（mL）÷匀浆液浓度（g/mL）

1.3.2 POD酶活性的测定。混匀后，3 500 r/min离心10 min，取上清液于波长420 nm处，1 cm光径比色杯，双蒸水调0，测定各管的吸光度。计算公式为：

POD活力=测定OD-对照OD1.2×比色皿光径（1 cm）×反应液总体积（mL）取样量（mL）÷反应时间（30 min）÷匀浆蛋白浓度（mgmL）×1 000

1.3.3 MDA酶活性的测定。混匀后，3 500 r/min离心10 min，取上清液于波长405 nm，光径0.5 cm，双蒸水调0，测定各管的吸光度。计算公式为：

MDA活力=271×（对照OD-测定OD）60×取样量÷待测样本蛋白浓度

1.3.4

出苗整齐度观察。种子盒与大田播种后，自然状态下观察出苗快慢与整齐度。

1.3.5 卷叶和挺拔程度观察。盆栽胁迫后干旱自然形态指标采用目测法于15：00记载卷叶与挺拔程度。

2 结果与分析

2.1 干旱条件下不同玉米品种发芽率和伤害率比較

以15%PEG-6000（wv）为渗透介质来模拟干旱条件。由表1可知，2个转基因品系与其各自受体的发芽率和伤害率与品种抗旱性关系密切。2个转基因品系T09100-3和H5T37的伤害率分别为17.64%、37.73%;受体品种综31和178分别为29.37%、44.44%，这表明转基因品系萌发比各自受体需水少，且前者好捉苗、成苗率高。同时，该结果与这2个转基因品系在种子盒与田间出苗的整齐度和快慢一致。因此，高渗溶液发芽试验是玉米幼苗抗旱性分析和鉴定的良好指标。

2.2 干旱条件下不同玉米品种芽根比的比较玉米籽粒萌动时，对抗旱有适应性变化，从而保证籽粒在水分胁迫条件下仍能吸收和保持一定量的水分，以满足其自身及叶芽的需要;根为了增强抗旱能力，在萌动发芽期往往根量变化大，主要表现是芽根比减小。从表2可以看出，在15%PEG-6000（wv）渗透介质模拟干旱条件下，2个转基因品系与其各自受体的芽根比都较对照（水中发芽）低，说明供试材料在渗透介质中发芽率均变小，而且芽根比也降低，这种形态上的变化易于抵抗逆境（如干旱与冷害）[8]。2个转基因品系比其各自受体的芽根比低，这与2个转基因品系在田间出苗的整齐度和快慢相一致。

2.3 不同玉米品种各时段离体叶片含水量的比较在五叶一心期采用保水力法鉴定转海藻糖合酶基因玉米的耐旱性。由表3可知，在充足供水条件下，不同玉米品种的含水量（占自然鲜重的百分率）之间差异较小;但随着离体时间的延长，差异逐渐变大。不同玉米品种的离体叶片含水量下降幅度由高到低依次为综31、T09100-3、178、 H5T37，这与盆内胁迫一段时间后叶片表现出的萎蔫一致，与大田苗期的表现也一致。

2.4 不同PEG浓度对玉米叶片SOD活性的影响

SOD是细胞抵御活性氧伤害的重要保护性酶之一，它在清除过氧化物、H2O2 和超氧自由基，减少或阻止羟基自由基形成以保持膜系统免受损伤方面起重要作用。水分胁迫下植株体内SOD活力的高低与其抗旱性密切相关，轻度或短期水分胁迫下植物 SOD 活力呈上升趋势，而在严重或长期胁迫条件下呈下降趋势[9]。该试验结果显示，随着PEG浓度的增大，转基因品系与各自受体植株体内SOD活力均呈先上升后下降的趋势（图1）。在15%PEG处理下，SOD活力升高说明其积极参与活性氧的清除，而当处理浓度为25%时，综31和178植株内SOD活力开始降低，并且随着处理浓度的变大，下降幅度增大;与对照相比，转基因植株T09100-3和H5T37在PEG浓度为25%和35%时，SOD活力均仍呈上升趋势;在PEG胁迫下，转基因植株体内的SOD活力显著高于对照，说明转基因植株具有更好的抗旱性。

2.5 PEG浓度对玉米叶片POD活性的影响 POD是植株体内另一种重要的保护性酶，POD和CAT共同作用，将SOD酶产生的H2O2进一步还原为H2O。在干旱胁迫下，POD和SOD的活力变化趋势基本相同：在胁迫初期，POD活力增加，说明适当的水分胁迫能增强玉米对干旱的适应性;但随着PEG浓度加大，POD活力开始下降，浓度为抗旱性好的品种的下降幅度小于抗旱性差的品种，因此POD是检验玉米抗旱性高低的标准之一。该试验结果显示，PEG浓度为15%时，4个材料的POD活力均上升，当浓度达到25%时，对照组的综31和178的POD活力开始下降，浓度为35%时下降幅度变大;而对应的转基因植株在PEG浓度为35%时仍然呈上升趋势。因此，在干旱胁迫下，转基因植株细胞能够更好地抵御活性氧伤害，维持其正常的生长发育。

2.6 PEG浓度对玉米叶片MDA含量的影响

丙二醛MDA是脂质膜过氧化的主要产物，其含量高低反映质膜过氧化作用强弱和质膜破坏程度的高低。研究表明，在干旱条件下，玉米不同基因型叶片组织中MDA含量均增加，且可以根据其增加幅度来判断抗旱性的强弱。由图3可知，随着PEG浓度的增大，植株叶组织中MDA的含量也逐渐增大;与对照综31和178相比，转基因植株T09100-3和H5T37的增加幅度明显较小，说明在干旱胁迫下转基因植株体内质膜过氧化程度低于对照，即其抗旱性强于对照。

2.7 不同玉米品种在种子盒、花盆和田间的耐旱性比较

2个转基因品系与各自受体分别在种子盒与大田播种，其转基因品系均比对照早出苗3 d，出苗整齐度较好。出苗期间田间干旱，种子盒人为蹲苗控水。从图4、5、6可以看出，转基因品系抗旱性明显强于对照;从图7、8可以看出，将2个转基因品系与各自受体播种在花盆内，从出苗到第5片叶完全展开时，盆内植株供水适量且充足，灌足水后进行水分胁迫7 d，结果发现转基因品系生长舒展挺拔，对照受体萎蔫卷曲叶片泛黄，说明转基因品系抗旱性强于对照。

3 结论与讨论

海藻糖是植物抵御各种胁迫环境的保护剂[7]，广泛存在于酵母、藻类和一些低等维管植物中，最高含量可达10%[10]。在干燥失水等恶劣环境下海藻糖细胞表面形成独特的保护膜，可有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程的生物特征，使生物体表现较强的抗旱能力[11-12]。因此，山西省农业科学院旱地农业研究中心利用基因枪法将海藻糖转入综31与178自交系，10多年来获得一大批转化品（株）系;该研究利用 T09100-3和H5T37品系进行了萌发期与苗期的抗旱性研究。

该试验结果表明，采用的萌发期与苗期抗旱性研究方法结果基本一致，均证明2个转基因品系（T09100-3和H5T37）分别比各自受体耐旱性强，该研究方法简单且有应用价值。该试验结果还显示，PEG溶液模拟干旱条件下的发芽试验叶片SOD、POD酶活性的测定均与种子盒、田间抗旱性观察结果基本相符，这说明基因转化过程中，在人为创造

的不利环境中选择抗旱性是可行的;在PEG模擬水分胁迫条件下测定转化品系种子发芽率、SOD酶活性、POD酶活性的变化规律以及苗期离体叶片保水力等，从而检验不同转基因品系抗旱性是一种有实用价值的实验室方法。

参考文献

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