Thermotoga sp. RQ7内切纤维素酶TsCel12A蛋白的酶学性质和晶体学研究

李 媛，张 丽，陈安琪，季朝能

(复旦大学 生命科学学院，上海 200438)

自然界中糖类至关重要.葡萄糖为生命体提供能量，脱氧核糖参与有机体遗传物质的组成，糖蛋白承担细胞内和细胞间信号交流的使者，光合作用合成的木质纤维素则是地球上最丰富的可再生资源[1]，蕴藏着巨大的应用前景.根据CAZy(Carbohydrate-Active Enzymes)数据库，作用于碳水化合物的酶可分为五大类，其中糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases, GHs)(EC 3.2.1)又称糖苷酶或糖基水解酶，可以催化O-，N-，S-糖苷键形成半缩醛糖或半缩酮糖和相应的糖苷配基[2]，按水解过程中产物糖分子异头碳羟基的拓扑结构是否发成变化，分为保留型或反转型两种催化机制[3].在糖苷水解酶中，涉及能源、食品、医药、化工原料等诸多领域[4]，应用前景[5-7]最大的一类酶为水解纤维素的酶类[8].在长期的进化过程中，纤维素为抵御被水解形成了复杂致密的超分子聚合结构，现普遍接受的纤维素降解过程是由内切纤维素酶、外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶进行协同作用[9-10].内切纤维素酶(EC 3.2.1.4)是参与纤维素水解反应第一步的酶类，其底物广泛[11]，可作用于纤维素、木聚糖、木葡聚糖、β-葡聚糖[12]等，其活性中心的三维结构通常为一个开放的裂隙[13]，助于与底物的结合，对非结晶区的糖链进行随机切割，产生寡糖和还原末端.目前关于内切纤维素酶的结构与功能报道分散在不同家族，在CAZy数据库中仅有少数成员的三维结构被收录，极大限制了我们对其发挥水解作用机制的理解.

在工业上，降解纤维素等原料的方法包括有研磨爆破等物理处理、酸碱有机溶剂等化学处理、以及酶处理.采用物理和化学处理往往成本较高且极易污染环境，将环保高效的水解酶而非化学制剂用于工业生产的需求越来越多.然而部分天然酶在工业应用时常存在缺陷[14]，获得能耐受工业生产环境的酶制剂成为亟待解决的科学难题[15-16].1983年Ulmer提出了分子水平对酶进行改造的蛋白质工程(Protein engineering)[17].值得注意的是: 通过随机突变或定向筛选[18]而获得的功能改善酶分子的过程耗时较长，且易发生酶的表达量或活性偏低等问题；通过转录、翻译后修饰而获得的酶在催化的高效性和折叠稳定性上往往存在问题.相比而言，如果可以从极端微生物中筛选出耐高温、高盐及酸碱环境的酶，并掌握其三维结构，无论是将其直接应用于工业生产，还是将其视为功能单元串联构建杂合酶，亦或是针对其活性催化结构域的再设计，都具备极高的社会效益和经济价值.因此，本课题希望能通过酶学性质的测定筛选出具备工业应用特性的内切纤维素酶[19]，开辟工业纤维素处理中酶制剂的环保应用路径；并通过三维结构的解析，探究出内切纤维素酶与纤维素等底物的结合和催化机制，为纤维素水解技术的革新提供思路，进而推动利用可再生资源解决能源危机，促进世界的可持续发展.

本文在前期对来自10种不同菌株的内切纤维素酶降解底物对硝基苯-β-D-纤维二糖苷研究的基础上，报道降解效果最好的来源于Thermotogasp. RQ7的内切纤维素酶TsCel12A的表达、纯化、酶学性质和X-射线晶体衍射的初步分析结果，希望这些工作能为内切纤维素酶类结构与功能关系的阐明及其在工业生产上的应用提供借鉴意义.

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌E.coliBL21(DE3)菌株、质粒pFD1由本实验室保存并提供.

1.2 TsCel12A重组表达载体的构建

重组质粒合成自: 苏州金唯智生物科技有限公司，将来源于Thermotogasp. RQ7的目的基因片段(GCGGAGGTCGTACTTACCGATATCGGGGCTACAGATATTACGTTCAAAGGTTTTCCAGTGAC-AATGGAACTCAATTTTTGGAACGTTAAGTCTTATGAAGGCGAGACTTGGTTAAAATTCGACG-GTGAAAAAGTCCAGTTTTACGCAGATATTTATAATATCGTATTGCAAAACCCTGATTCCTGG-GTGCACGGGTACCCAGAAATTTATTACGGTTATAAGCCTTGGGCCGCTCATAATTCAGGCACC-GAGATTCTGCCGGTTAAAGTCAAAGACCTTCCAGATTTTTACGTAACACTCGATTATTCGAT-CTGGTACGAAAACGACTTACCTATTAATTTGGCAATGGAAACGTGGATTACACGCAAGCCAG-ATCAGACTAGTGTGAGCTCTGGTGATGTTGAGATCATGGTCTGGTTCTATAACAATATTCTG-ATGCCTGGGGGTCAAAAAGTAGACGAATTTACCACAACGATTGAAATCAACGGCTCCCCGGT-GGAGACAAAATGGGATGTTTACTTTGCGCCATGGGGTTGGGATTATCTTGCTTTCCGTCTCA-CTACCCCTATGAAGGACGGGCGTGTCAAATTTAATGTAAAAGATTTTATGGAAAAGGCAGCC-GAAGTGATTAAAAAATACTCAACACGCGTTGAGAACTTCGAAGAAATGTATTTTTGTGTCTG-GGAGATTGGTACGGAATTTGGCGATCCAGACACAACTGCTGCAAAGTTCGGTTGGACCTTTA-AAGATTTTTCGGTAGAAACAAAATAACTCGAG)通过限制性内切酶NheⅠ和XhoⅠ双酶切后连接质粒片段，构建出pFD1-His-TsCel12A重组表达载体，保存于E.coliDH5α菌株.采用Axygen质粒小量提取试剂盒提取重组质粒，转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，并制成25%甘油菌于-20℃冻存.

1.3 TsCel12A的表达与纯化

吸取甘油菌接种于含有50μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中，在37℃条件下200r/min培养过夜.再按每20mL过夜菌接种于1L含有50μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中，共摇菌8L于37℃扩大培养.待菌浓度值OD600达到0.6～0.8时，降温至16℃，加入0.5mmol/L IPTG继续培养20h.5000r/min离心10min收集菌体，用缓冲液A(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑)冰上重悬，采用聚能高压细胞破碎仪破碎菌体后，于4℃条件下15000r/min离心40min留取上清.

目的蛋白的纯化采用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析的方法进行.先将上清借助AKTA层析仪上样到GE Healthcare公司5mL的HisTrapTMHP预装柱(已用缓冲液A平衡)中，待目的蛋白吸附在层析柱后，用缓冲液B(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，300mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑)自8%起始至100%梯度洗脱，收取每一个蛋白峰的样品进行SDS-PAGE电泳验证.将蛋白条带大小正确的洗脱样品浓缩至5mL，上样于GE公司HiPrep 26/60 Sephacryl S100凝胶过滤层析柱(已用缓冲液C平衡)，用缓冲液C(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/L NaCl，1mmol/L DTT)平衡洗脱，收集出峰样品.进行SDS-PAGE电泳验证，并切下目的带胶条，送样于质谱检测平台进行MALDI-TOF质谱分析.确认纯化所得为目的蛋白后，浓缩换液，Bradford法测定蛋白浓度，液氮速冻，存于-80℃备用.

1.4 TsCel12A酶学性质的测定

TsCel12A酶学性质的测定选用对硝基苯-β-D-纤维二糖苷为底物，采用终止反应法，即反应体系100μL，底物浓度0.25mmol/L，加入酶反应10min后迅速置于冰上终止反应，于400nm波长下检测产物对硝基苯酚的吸收值，设定不加入酶的同反应体系为空白对照组，进行3组重复实验，并计算3次重复实验结果的标准差.在预实验初步确定的95℃最适反应温度条件下，选取pH3.0～6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH6.0～7.5磷酸缓冲液、pH7.0～8.5 Tris-HCl缓冲液和pH8.5～11.0甘氨酸-氢氧化钠(Gly-NaOH)缓冲液各100mmol/L，同时进行反应，测得酶的最适反应pH.在最适的pH缓冲液中，分别于30，40，50，60，65，70，75，80，85，90，95，100℃不同温度下进行反应，测定酶的最适反应温度.在最适反应温度和最适反应pH条件下，保持加入反应的酶量不变，分别测定在0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，0.6，1.0，1.5，2.0，2.5mmol/L不同底物浓度下的反应速率，通过拟合米氏方程计算出Km、Vmax和Kcat动力学参数.将一定量的NaCl加入pH9.0Gly-NaOH缓冲液中溶解，分别配成含5，4，3，2，1mol/L NaCl的Gly-NaOH缓冲液(pH9.0)，设置不加入NaCl的Gly-NaOH缓冲液(pH9.0)为对照组，测定TsCel12A在不同盐浓度条件下的酶活力.

1.5 TsCel12A的结晶和X-衍射数据收集

晶体初筛采用气相坐滴扩散法，选取Hampton公司的Index Screen HT，Crystal Screen HT和Rigaku公司的Wizard Ⅰ～Ⅳ 4套条件，采用Intelliplate96孔板，借助Art Robbins Instruments的Gryphon结晶系统操作，放于20℃生长观察.晶体优化采用气相悬滴扩散法，主要调整初筛条件中的pH值(X轴梯度)和沉淀剂浓度(Y轴梯度)，放于20℃培养观察，根据每一回合优化区间中晶体的生长情况改进下一次优化设计中针对pH和沉淀剂浓度的调整方向及范围，逐渐确定较适宜晶体生长的条件，获得有利于衍射的高质量晶体.酶与底物的共结晶，按物质摩尔浓度比酶与底物1∶5或1∶10，在最优的条件下共结晶生长.将用于衍射的晶体捞出于含25%甘油的防冻剂液滴后迅速放到液氮冷却好的Puck里.X-射线衍射数据收集于上海同步辐射光源(SSRF)BL17U线站.每旋转1°收集一张衍射图，所得数据用HKL2000处理整合.

2 结果与讨论

2.1 TsCel12A融合蛋白的纯化

TsCel12A融合蛋白在E.coliBL21(DE3)菌株中表达，His-TsCel12A共有277个氨基酸残基，理论大小约为34kDa.在重复纯化的过程中，目的蛋白位置附近存在十分接近且难以分离的条带(图1(a)，@@@492页）.因其酶学性质的测定表明此酶在80℃以上的高温环境中不发生变性，故对破碎后的菌体取得的上清增加80℃处理30min后15000r/min离心15min的操作以提高纯度.将热处理后二次离心的上清进行镍柱亲和层析，纯化得到了位置均一的洗脱样品(图1(b)，@@@492页）.将样品浓缩至5mL，经凝胶过滤层析柱洗脱得到了单一蛋白峰(图1(c)，@@@492页），进行SDS-PAGE检验，目的蛋白纯度可达95%以上，位置较理论值偏小，原因可能为热处理过程使其构型更加紧密.对照凝胶过滤层析中标准品的出峰体积(图1(d)，@@@492页），判断TsCel12A蛋白在溶液中以单体形式存在.进行MALDI-TOF质谱分析，检测到了第38～60位、第191～221位、第265～277位氨基酸肽段的信号(表1)，且期望值0.00017<0.01，进一步验证了所获蛋白为目的蛋白.Bradford法测定蛋白浓度约为15mg/mL.

表1 MALDI-TOF质谱检测到的肽段分析

(续表)

图1 TsCel12A蛋白的纯化过程分析Fig.1 Purification of TsCel12A(a) Ni-NTA亲和层析SDS-PAGE胶图.M为蛋白Marker，T为全菌样5倍稀释，S为菌体破碎离心后的上清，FT为上清流过Ni-NTA介质后组分，50E为含有50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑的淋洗组分.1～7为缓冲液B洗脱组分(分管接收，2mL/管).样品及Marker上样体积均5μL.(b) Ni-NTA亲和层析SDS-PAGE胶图.HS为菌体破碎离心后上清80℃处理30min后15000r/min离心后上清.其他参数同(a).(c) 凝胶过滤层析蛋白280nm吸收峰图.下方为SDS-PAGE检测蛋白峰收集的组分胶图(分管接收，1mL/管).(d) 使用标准品校正HiPrep 26/60 Sephacryl S100层析柱出峰位置所对应蛋白大小的标准曲线.

2.2 TsCel12A酶学性质的研究

根据酶学性质实验的测定:TsCel12A为热稳定性酶，最适反应温度为95℃(图2(a)).在低于30℃时，基本不发挥酶活力.随着温度的升高，活性逐渐增强，当温度高于85℃时酶活性保持80%以上，在95℃时达到最高的酶活力，在极高温度下进行酶促反应.TsCel12A最适反应pH为9.0(图2(b))，不耐受酸性条件，pH低于6.0时基本不发挥酶活力，较适宜碱性条件，pH8.5～9.5环境下酶活性保持80%以上，在pH值相等的不同缓冲液环境，酶活性存在差异，具体表现为pH7.0时，TsCel12A在磷酸缓冲液中的酶活力高于Tris-HCl缓冲液；pH7.5时，在Tris-HCl缓冲液中的酶活力高于磷酸缓冲液；pH8.5时，在Gly-NaOH缓冲液中的酶活力高于Tris-HCl缓冲液.这可能是因为不同离子对酶活性中心存在不同的静电作用从而影响了酶活力.根据反应速率随底物浓度的变化结果(图2(c))计算出TsCel12A的Km为(0.3602±0.0343) mmol/L，Vmax为(0.1210±0.0032) mmol/(L·min)，Kcat为(4.58±0.1211) s-1.TsCel12A具备一定的耐盐性(图2(d))，在含1mol/L NaCl的缓冲液中相对活性为62%，在含5mol/L NaCl的缓冲液中尚未丧失酶活力，相对活性保持35%.以上结果表明在高温、高盐或碱性等严苛工业环境中，TsCel12A具备良好的应用前景.

图2 TsCel12A酶学性质的研究Fig.2 Biochemical properties of TsCel12A(a) 测定TsCel12A酶促反应的最适温度.在100mmol/L pH9.0 Gly-NaOH缓冲液中，测定30～100℃范围内不同温度对酶活力的影响.温度为95℃时表现出最大酶活力，设定此温度对应的数值为100%.(b) 测定TsCel12A酶促反应的最适pH.在95℃下，测定pH3～11范围内100mmol/L不同缓冲液对酶活力的影响.倒三角形所在曲线代表柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0～6.0)，正三角形代表磷酸缓冲液(pH 6.0～7.5)，圆形代表Tris-HCl缓冲液(pH 7.0～8.5)，方形代表Gly-NaOH缓冲液(pH 8.5～11.0).在pH 9.0 Gly-NaOH缓冲液中表现出最大酶活力，设定此条件对应的数值为100%.(c) 测定酶促反应动力学曲线.在95℃下100mmol/L pH9.0 Gly-NaOH缓冲液中，测定不同底物浓度下的反应速率，再根据米氏方程计算动力学参数.(d) 测定TsCel12A的耐盐性.将不加NaCl的对照组酶活力结果设定为100%，当P<0.05时，认为存在显著性差异(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001).

2.3 TsCel12A结晶条件的筛选和优化

将纯化后浓度约为15mg/mL的TsCel12A采用坐滴法在96孔板上进行晶体初筛.20℃培养一周后观察到有晶体长出，生长条件分别是Crystal ScreenHT 71: 1.6mol/L Ammoniμm sulfate，0.1mol/L MES monohydrate pH 6.5，10%(体积比)1，4-Dioxane(图3(a)，@@@494页）和Wizard Ⅲ & Ⅳ 49: 16%(密度)PEG 8000，40mmol/L Potassiμm phosphate dibasic，20%(体积比)Glycerol(图3(b)，@@@494页）.针对初筛条件晶体的优化采用悬滴法在24孔结晶板中进行.Crystal Screen HT 71的优化范围为1.6mol/L Ammoniμm sulfate，0.1mol/L MES monohydrate pH 5.2～7.1，6%～16%(体积比)1，4-Dioxane，优化终条件为1.6mol/L Ammoniμm sulfate，0.1mol/L MES monohydrate pH 7.0，10%(体积比)1，4-Dioxane，所得晶形为平行四边体(图3(a)).Wizard Ⅲ & Ⅳ 49的优化范围为40mmol/L Potassium phosphate dibasic，10%～25%(体积比)Glycerol，10%～22%(密度)PEG 8000，优化终条件为40mmol/L Potassiμm phosphate dibasic，26%(体积比)Glycerol，18.5%(密度)PEG 8000，所得晶形为伞形(图3(b)).

图3 TsCel12A蛋白晶体的生长和X-衍射情况Fig.3 Crystals and X-ray diffraction of TsCel12A(a) 从左至右依次为15mg/mL的TsCel12A在Crystal Screen HT 71初筛条件下生长的晶体图，在其条件优化后生长的晶体图，用直径为0.2mmloop环挑取的优化终条件中用于X-射线衍射的平行四面体单晶，TsCel12A单晶在X-射线下的曝光图(波长: 0.9793Å，间距: 300.00mm).(b) 从左至右依次为15mg/mL的TsCel12A在Wizard Ⅲ & Ⅳ 49初筛条件下生长的晶体图，在其条件优化后生长的晶体图.(c) 40mg/mL的TsCel12A在Crystal Screen HT 14初筛条件下生长的晶体图.

2.4 TsCel12A晶体衍射数据的收集

捞取Crystal Screen HT 71条件中的平行四边体单晶(135μm×90μm×10μm)，和Wizard Ⅲ & Ⅳ 49条件中的伞形晶体，于SSRF的BL17U线站衍射，均未收集到有效的衍射点(图3(a)).在Crystal Screen HT 71优化条件的基础上尝试了添加剂和分别与葡萄糖、β-D-纤维二糖和对硝基苯-β-D-纤维二糖苷3种底物进行共结晶，共结晶均为沉淀，尚未有加强作用.将重新纯化的浓度约为40mg/mL的TsCel12A进行结晶，筛选出Crystal Screen HT 14条件: 0.2mol/L Calcium chloride dihydrate，0.1mol/L HEPES sodium pH 7.5，28%(体积比)Polyethylene glycol 400，所得晶型为平行六面体(图3(c))，于SSRF的BL17U线站衍射，获得晶体数据(表2).TsCel12A蛋白晶体的分辨率2.36Å，所属空间群为P 6 2 2，晶胞参数为a=184.974，b=184.974，c=49.873，α=90°，β=90°，γ=120°.

表2 TsCel12A晶体数据

综上所述，本文在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中成功表达纯化了来源于Thermotogasp. RQ7的属于糖苷水解酶第12家族的内切纤维素酶TsCel12A蛋白.并根据酶学性质实验，测定出酶的最适反应温度、最适反应pH及相关动力学参数，发现了其极端嗜热、耐碱和耐盐的特性.在晶体学研究过程中通过不断的摸索优化，找到了有利于衍射的结晶条件，获得了TsCel12A蛋白晶体.通过X-射线晶体衍射收集数据，解析出了TsCel12A蛋白所属的空间群和一系列晶胞参数.已报道的糖苷水解酶第12家族内切纤维素酶的结构多为经典的jelly-roll折叠，由A、B两大β-sheets构成，其中每个β-sheet包含多个反向平行的β-strands，片层间常有α-helix进行连接.处于内部的β-sheet包含活性中心，形态多为裂隙，处于外部的β-sheet则更多与酶的稳定性有关[20-22]，关于TsCel12A的结构解析正在进行.

同时酶与底物的共结晶条件也在进一步摸索，希望能获得酶催化底物进行反应的结构状态.除酶的野生型外，针对关键催化位点突变体的酶学性质及晶体结构也有待于进一步探究.希望这些工作能最终揭示出TsCel12A蛋白水解纤维素糖链的具体催化机制，为更充分利用纤维素等生物能源提供新的科学依据.