蜂王浆-β-环糊精包合物的主要营养成分及抗氧化活性

刘佳霖，高丽娇，曹 兰，罗文华，杨金龙，戴茜茜，程 尚，姬聪慧

(重庆市畜牧科学院，重庆402460)

蜂王浆是我国重要的天然、绿色保健蜂产品，含有丰富的蛋白质、氨基酸及10-羟基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA）等生物活性物质[1-3].大量研究表明[3-8]，蜂王浆具有减缓人体衰老、提高机体免疫力、促进细胞增殖、抗菌消炎、调节血压及血糖等多种营养保健及医疗功能，也可应用于食品、医疗及日化等多个行业.然而，新鲜蜂王浆仅能在-20℃冷冻条件下长期储存，其稳定性及水溶性较差，且具有酸涩辛辣的不良口感，极大地降低了蜂王浆的商品价值，限制了蜂王浆在多领域中的应用[9-12].由此，探索改善蜂王浆不良特性的新型技术，制备易于保存及添加的蜂王浆制品具有重要的意义.

β-环糊精（β-cyclodextrin）是由7个葡萄糖通过α-1，4糖苷键连接而成的桶型低聚糖，具有内疏水外亲水的空腔结构，能够通过包合反应对原料小分子物质进行包埋，改变原料原有的物理及化学特性，形成稳定性及水溶性较高的包合物[13-15].基于β-环糊精制备的包合物并没有改变原料原本的化学结构，且包合反应条件温和，对其营养成分及功能活性影响较小[16，17].目前，环糊精包合技术已广泛应用于食品、医药及日化等多个行业，在提高原料稳定性、水溶性及改善不良口感等方面发挥着重要作用.研究显示，β-环糊精包合技术能够显著提高蜂王浆的稳定性及水溶性，蜂王浆-β-环糊精包合物的水溶性蛋白质含量占王浆总蛋白含量的92.06%，显著高于其他植物蛋白酶酶解产物；此外，酸、碱、热及72 h常温处理对包合物无显著影响[18].前人的研究已初步证实了环糊精包合技术在提高蜂王浆稳定性及水溶性方面的作用，但有关包合物的营养价值及功能活性仍未有报道.

本研究以10-HDA含量、17种氨基酸含量和组成以及抗氧化活性为主要指标，分析蜂王浆-β-环糊精包合物的主要营养成分及功能活性，明确包合技术在蜂王浆深加工中的具体作用，为包合技术在蜂王浆深加工中的实际应用提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜蜂王浆购自重庆佳联生物技术有限公司；β-环糊精购自河南金润食品添加剂有限公司；亚油酸购自 Macklin；2，2-联苯基-1-苦基肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl， DPPH）购自 Macklin；总抗氧化能力（total antioxidant capability，T-AOC）试剂盒购自南京建成；硫氰酸铵NH4SCN购自Macklin；氯化亚铁FeCl2（分析纯）购自天津市大茂化学试剂厂；超滤离心管（50 mL 3 ku）购自Millipore.

1.2 仪器与设备

LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；L-8900氨基酸自动分析仪（日本日立高新技术公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；H4-4数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；C-MAG HS4磁力搅拌器（IKA）.

1.3 方法

1.3.1 蜂王浆-β-环糊精包合物的制备 依据文献中β-环糊精包合蜂王浆的基本工艺[18]并加以调整，获得本研究的包合反应工艺，即：制备料液比为1∶9的蜂王浆水溶液，调节pH＝8.7，准确加入β-环糊精至终浓度为12.50 mg·mL-1，在27℃下搅拌反应5 h，过滤，所得滤液即为蜂王浆-β-环糊精包合物.该包合物的水溶性蛋白提取率为97.28%±0.15%，明显高于文献中蜂王浆包合物的水溶性蛋白质提取率.

1.3.2 蜂王浆-β-环糊精包合物 10-羟基-2-癸烯酸含量的测定 参照标准 GB 9697—2008《蜂王浆》[19]，采用高效液相色谱法测定蜂王浆及其β-环糊精包合物的10-HDA含量，并根据稀释倍数对结果进行计算.

1.3.3 蜂王浆-β-环糊精包合物17种氨基酸含量的测定 参照标准GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》[20]，采用盐酸水解—氨基酸自动分析仪法测定蜂王浆及其包合物17种氨基酸的含量.分别计算蜂王浆及其包合物中必需氨基酸含量（essential amino acids，EAA）、非必需氨基酸含量（non-essential amino acids，NEAA）、总氨基酸含量（amount of amino acids，TAA）、必需氨基酸与总氨基酸的比值（EAA／TAA）以及必需氨基酸与非必需氨基酸的比值（EAA／NEAA），并参考FAO／WHO推荐的氨基酸模式谱，对蜂王浆及其包合物蛋白质的营养价值进行评价[21，22].

1.3.4 蜂王浆-β-环糊精包合物的抗氧化活性测定 将制备的包合物过滤，选择截留分子量为3 ku的超滤离心管进行超滤（5000×g，4℃，60 min），超滤后获得2种肽段产物，即＞3 ku及0～3 ku肽段产物，并使用容量瓶将两种肽段产物定容至超滤前包合物的加样体积.

（1）抑制亚油酸氧化的测定.参考许建香等[23]的方法，取原王浆溶液、包合物及两种肽段产物各1 mL，分别加入1 mL浓度为2.51%的亚油酸无水乙醇溶液，再加入2 mL 0.05 mol·L-1的磷酸缓冲液和1 mL无水乙醇（待测样品）或去离子水（空白对照），封闭后放在暗处保持40℃恒温.取50 μL上述溶液，加入 4.85 mL 75%的乙醇溶液和 50 μL 30%的 NH4SCN，再加入 50 μL 0.02 mol·L-1溶解于 3.5%盐酸的FeCl2，准确反应3 min后测定其在500 nm处的光密度，以后每隔24 h测定1次.

（2）清除DPPH自由基能力的测定.参考许建香等[23]的方法，使用无水乙醇溶解DPPH，使其浓度为0.2 mmol·L-1（78 mg·L-1），取原王浆溶液、包合物及两种肽段产物的稀释溶液（稀释10倍）各2 mL，分别加入2 mL 0.2 mmol·L-1的DPPH溶液，混匀，以溶剂为对照在520 nm处测定其光密度（D1）；同时，原王浆溶液、包合物及两种肽段产物的稀释溶液各2 mL，分别加入2 mL无水乙醇，充分混匀，测定其520 nm处的光密度（D2），测定空白对照的520 nm处光密度（D3）.抑制率根据下列公式计算：

（3）总抗氧化能力测定.采用T-AOC试剂盒测定原王浆溶液、包合物及两种肽段产物的总抗氧化能力，根据试剂盒说明在样液中依次加入试剂，放置10 min，分别记录520 nm光密度（D），根据下列公式计算其总抗氧化能力.

1.4 数据分析

采用Excel 2007版进行数据整理.蜂王浆及其包合物的10-HDA含量、17种氨基酸含量及抗氧化活性采用SPSS 16.0独立样本T检验或LSD检验进行显著性分析，P＜0.05达到显著水平.

2 结果与分析

2.1 蜂王浆-β-环糊精包合物10-羟基-2-癸烯酸含量

蜂王浆-β-环糊精包合物的10-HDA含量与新鲜蜂王浆差异不显著（P＞0.05），环糊精包合技术的反应条件对蜂王浆10-HDA含量无显著影响（图1）.

图1 蜂王浆及其β-环糊精包合物的10-羟基-2-癸烯酸含量Fig.110-HDA contents in royal jelly and β-cyclodextrin inclusion complex

2.2 蜂王浆-β-环糊精包合物的氨基酸含量及营养价值评价

蜂王浆及其包合物氨基酸种类齐全，均含有被检测的17种氨基酸，其中含量较高的氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸及丝氨酸（表1）.包合物中各氨基酸含量及TAA与新鲜蜂王浆无显著差异（P＞0.05）；蜂王浆经β-环糊精包合后，其 EAA／TAA 及 EAA／NEAA无明显变化，并接近或高于FAO／WHO推荐的 0.40 和 0.60[22].

表1 蜂王浆及其β-环糊精包合物的氨基酸含量1)Table 1 Amino acids contents in royal jelly and β-cyclodextrin inclusion complex

本研究基于FAO／WHO推荐的氨基酸模式谱对蜂王浆及其β-环糊精包合物的蛋白质营养价值进行评价（表2）.蜂王浆及其包合物中各必需氨基酸占总氨基酸的质量分数无明显差异，除蛋氨酸＋胱氨酸略低于推荐标准外，两种样品的其他各种必需氨基酸比例均高于推荐标准.说明，蜂王浆及其β-环糊精包合物可以作为人体摄取必需氨基酸的重要食源.

2.3 蜂王浆-β-环糊精包合物的抗氧化活性

2.3.1 抑制亚油酸氧化的能力 蜂王浆-β-环糊精包合物抑制亚油酸氧化的能力如图2所示，与空白对照相比，蜂王浆水溶液及包合物＞3 ku肽段产物对亚油酸的氧化无抑制作用，但包合物及其0～3 ku肽段在0～7 d能够抑制亚油酸氧化，其中，0～3 ku肽段的抑制效果最好且更持久.由试验数据判断，蜂王浆水溶液及包合物＞3 ku肽段产物对亚油酸的氧化可能存在促进作用.

表2 蜂王浆及其β-环糊精包合物必需氨基酸组成与FAO／WHO模式比较Table 2 Comparison of amino acid composition among royal jelly， βcyclodextrin inclusion complex， and FAO／WHO recommendation

图2 添加蜂王浆及其β-环糊精包合物的亚油酸-NH4SCNFeCl2反应体系吸光度随时间的变化Fig.2 Changes in absorbance of solution linoleic acid-NH4SCN-FeCl2 added with β-cyclodextrin inclusion complex with time

2.3.2 清除DPPH自由基的能力 如图3所示，蜂王浆-β-环糊精包合物及其0～3 ku肽段产物清除DPPH 自由基的能力显著低于蜂王浆水溶液（P＜0.05），0～3 ku肽段的抑制率显著低于包合物（P＜0.05），包合物＞3 ku肽段未检出具有清除DPPH的能力.

图3 蜂王浆及其β-环糊精包合物清除DPPH的能力Fig.3 DPPH radical scavenging activities of β-cyclodextrin inclusion complex and royal jelly

2.3.3 总抗氧化能力测定 蜂王浆水溶液、包合物、0～3 ku和＞3 ku肽段产物的总抗氧化能力差异显著（P＜0.05），总抗氧化能力由大到小依次为蜂王浆水溶液、＞3 ku肽段、包合物及0～3 ku肽段（图4）.

图4 蜂王浆及其β-环糊精包合物总抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant capabilities of β-cyclodextrin inclusion complex and royal jelly

3 讨论

β-环糊精包合技术是一种应用广泛的蛋白质物理改性技术，能够显著提高原料的稳定性及水溶性，并更好地保留原料的营养价值及保健功能[16，17].研究显示，β-环糊精包合技术能够明显改善蜂王浆的稳定性及水溶性[18]，但包合物的营养价值及保健功能仍没有相关报道.10-HDA是蜂王浆重要的生物活性物质，约占蜂王浆鲜重的2%，具有增强免疫、抗癌、抗菌消炎及抗辐射等多种保健功能，其含量是评价蜂王浆质量的重要指标之一[24].本研究显示，蜂王浆-β-环糊精包合物10-HDA含量与新鲜蜂王浆无显著差异，包合技术的反应条件对蜂王浆的10-HDA影响较小.

蛋白质是蜂王浆最重要的营养物质之一，约占蜂王浆干重的36.0%～55.0%，蜂王浆中蛋白质的营养价值是决定蜂王浆品质的重要因素[9，21，25].现代营养学普遍认为，食物中蛋白质的营养价值与其氨基酸组成密切相关，其必需氨基酸的含量及组成是影响食物蛋白质营养价值的关键因素[26].本研究显示，蜂王浆-β-环糊精包合物17种氨基酸含量及必需氨基酸组成与新鲜蜂王浆无显著差异；与FAO／WHO推荐的氨基酸模式谱比较表明，除蛋氨酸与胱氨酸低于推荐标准外，蜂王浆及其包合物的其他必需氨基酸比例均优于推荐标准.因此，食用蜂王浆及其包合物可为人体提供丰富且均衡的必需氨基酸，β-环糊精包合技术对蜂王浆的蛋白质营养价值无显著影响.

机体内产生和积累的自由基对DNA、多糖、蛋白质、酶及脂质等生物活性物质的氧化损伤是导致衰老和多种病变的主要因素[27，28].亚油酸是一种ω-6多不饱和脂肪酸，是人体生长发育的必需脂肪酸，极易在自由基的作用下发生氧化，其产生的氧化产物对动脉粥样硬化及癌症的发生具有促进作用[28].本研究显示，蜂王浆-β-环糊精包合物抑制亚油酸氧化的能力显著高于新鲜蜂王浆，其中包合物0～3 ku的肽类物质抑制能力最强且更持久.由此表明，β-环糊精包合技术可用于制备具有较高抑制亚油酸氧化活性的蜂王浆制品.在抑制亚油酸氧化的试验中，蜂王浆水溶液及包合物＞3 ku的肽类物质对亚油酸的氧化可能存在促进作用，原因可能是两种溶液中的大分子蛋白质在乙醇溶液中变性沉淀，进而引起500 nm处吸光度的增高，样液并未促进亚油酸氧化，该结果与许建香等[23]研究一致.在本研究中，包合物及其＞3 ku、0～3 ku的肽类物质清除DPPH自由基的能力及总抗氧化能力显著低于新鲜蜂王浆.造成该结果的原因可能与包合物发挥缓释性能的原理有关，β-环糊精在包合蜂王浆的过程中，活性蛋白或酶的功能基团包埋在环糊精的桶型结构内，导致其抗氧化活性不能快速表现，使包合物的抗氧化活性显著降低，但包合物的稳定性明显优于蜂王浆，其缓释性能可延长包合物的抗氧化活性.在本研究中，蜂王浆-β-环糊精包合物在40℃条件下仍能长时间维持抑制亚油酸氧化的能力，也证实了包合物具有更高的稳定性及更加持久的抗氧化活性.这也与高瑞英等[29]研究结果一致，阿魏酸-α-环糊精包合物清除自由基的能力弱于阿魏酸，但包合物的抗氧化作用更加持久.

综上所述，β-环糊精包合技术可以显著提高蜂王浆抑制亚油酸氧化的能力，其包合物10-HDA含量及蛋白质营养价值与新鲜蜂王浆基本一致，包合物清除DPPH自由基及总抗氧化能力有所减弱，但抗氧化作用更持久.结合包合物较高的稳定性及水溶性，本研究认为，基于环糊精包合技术制备水溶性蜂王浆在食品、医药等领域具有良好的应用前景.