FAdV-4 NP株F1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

陈 媛，屈贵蜀，彭尧舜，许丽惠，王全溪

(福建农林大学动物科学学院，福建福州350002)

禽腺病毒（fowl adenovirus，FAdV）是腺病毒科禽腺病毒属中的一员.按照基因组的群特异抗原，分为5个群（A-E）和 12 个血清型（1～7、8a、8b、9～11）[1]，其中，Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒（fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4）以侵害肝脏为主，并在肝细胞中形成核内包涵体.近年来，世界各地都爆发安卡拉病[2]，这是由FAdV-4引起的以心包积水、肝脏坏死为主要特征的传染性疾病，故又被称为肝炎—心包积水综合征（hydropericardium hepatitis syndrome，HHS）[3].研究表明，引起安卡拉病与包涵体肝炎的病毒虽然都是FAdV-4，但是病毒的主要结构蛋白的基因存在较大变异[4].1987年FAdV-4首次在巴基斯坦被报道，而后印度[5]、韩国[6]也报道了FAdV-4的流行；中国在2007年发现少数该病毒，2015年后FAdV-4在中国呈现大面积爆发的趋势.

FAdV为无囊膜、双股线状的DNA病毒，其核衣壳由五邻体（penton）、六邻体（hexon）和纤突蛋白（fi-ber）等主要结构蛋白构成[7].有研究证明，纤突蛋白在病毒感染过程中扮演着重要的角色.缺少fiber2蛋白，会影响病毒的复制过程，也会使机体产生中和抗体的量降低[8]；而缺少fiber1（F1）蛋白，会减弱野生型病毒与宿主细胞膜上受体的结合程度，但病毒仍能感染宿主并进行复制[9]；同时，F1蛋白参与病毒的扩散，其产生蛋白的免疫原性较强，可作为研发基因疫苗的候选蛋白[10].因此，对F1蛋白结构及其功能的研究具有十分重要的意义.

本试验先对F1基因序列进行优化，构建FAdV-4 F1蛋白的重组质粒，获得F1基因的高表达蛋白，并得到高效价的多克隆抗体，为后期深入研究FAdV-4奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

FAdV-4 NP株，由本实验室分离鉴定并保存；DH-5α感受态细胞、pet-32a载体购自兰博利德试剂有限公司，高纯度质粒小提中量试剂盒、DNA提取试剂盒购自福州轩创生物技术公司，KpnI QuickCut、BamHI QuickCut限制性内切酶购自兰博利德试剂有限公司，羊抗兔IgG（二抗）、完全弗氏佐剂（complete freundadjuvant）、不完全弗氏佐剂（incomplete freundadjuvant）购自北京全式金生物技术有限公司，新西兰黄兔购自福建农林大学派尼尔兔园.

1.2 F1基因的扩增

从NCBI上下载FAdV-4 F1基因的序列（KU991797.1），用DNAman软件设计一对特异性引物：FAdV-4 F1（F）5′-CGAGGTACCTTAGATAGCGTTACCGGCGTTCTGA-3′（KpnI）；FAdV-4 F1（R）5′-CGGGATCCGGTGAACGCGATCGCATCGCT-3′（BamHI）.提取FAdV-4病毒的DNA模板，经PCR扩增，并纯化PCR产物，送上海生工生物工程股份有限公司测序，然后分析序列表达效率，优化密码子.

1.3 重组质粒pET-32a-F1的构建、鉴定

在PCR仪上用限制性内切酶KpnI和BamHI分别对纯化的PCR产物和pET-32a进行双酶切2 h，后81℃灭活30 min，16℃连接6 h.然后转到DH-5α感受态细胞中，隔天挑菌进行PCR扩增、测序，提取质粒进行酶切鉴定[11].鉴定正确后，将重组质粒转到BL21中，进行PCR验证.

1.4 序列优化前后表达效率对比

分别构建优化前后的F1基因重组质粒，转化BL21，扩大培养，200 r·min-1、37℃摇床中孵育4 h后，设诱导组1和诱导组2（IPTG终浓度为1 mmol·L-1），再孵育3 h，收集菌液进行离心，用PBS重悬沉淀，加蛋白Buffer于沸水煮10 min，再经SDS-PAGE电泳分析.

1.5 F1重组蛋白诱导表达体系的优化及纯化

重新摇菌，保持温度 37 ℃、时间 5 h 不变，分别加入 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2 mmol·L-1IPTG 进行诱导，筛选最佳诱导浓度；保持浓度为 0.3 mmol·L-1、温度 37 ℃不变，将孵育时间设为 1、3、5、7、9 h 取样，筛选最佳诱导时间；保持浓度为0.3 mmol·L-1、时间5 h不变，将F1蛋白置于4、25、37、50℃孵育，筛选最佳诱导温度.将待纯化的蛋白依次经过40、80、120、200、250 mmol·L-1咪唑洗脱，并收集液体，经SDS-PAGE电泳，确定最佳洗脱浓度.

1.6 F1基因多克隆抗体的制备、Western blot鉴定及血清效价的检测

1.6.1 F1基因多克隆抗体的制备及Western blot鉴定 将纯化后的F1蛋白和完全弗氏佐剂以1∶1混合，皮下注射于新西兰黄兔（首次免疫）；15 d后进行二次免疫（步骤同首次免疫）；二次免疫15 d后，将F1蛋白和不完全弗式佐剂以1∶1混合进行第3次免疫；第3次免疫4 d后于兔子心脏采血，8000g下离心5 min，收集血清，以F1蛋白（已纯化）为抗原，待检兔血清为一抗，进行Western blot鉴定.

1.6.2 间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测F1基因多克隆抗体血清效价 ①包被抗原：用碳酸盐缓冲液包被F1抗原（15 mg·mL-1），至于4℃冰箱过夜.②洗涤：倒掉包被液，并置于干净的纱布上拍干，用含有0.05%吐温的PBS洗涤3次，每次3 min.③封闭：每孔加入200 μL封闭液（含5%BSA的PBST缓冲液），37℃下封闭1 h.④洗涤：步骤同②.⑤加待检血清：将待检的兔血清按照1 ∶1000、1 ∶2000、1 ∶4000、1∶8000……1 ∶16384000进行稀释，同时设置空白对照、阴性对照，37℃下孵育1 h.⑥洗涤：步骤同②.⑦加酶标二抗：每孔加100 μL羊抗兔（IgG）（1∶5000稀释），37℃下孵育1 h.⑧洗涤：步骤同②.⑨加底物显色：每孔加100 μL TMB显色液，37℃下闭光显色30 min.⑩终止反应：每孔加100 μL H2SO4终止液.结果判定：酶标仪检测样品光密度（D450nm），以空白孔调零，当阳性血清与阴性血清的比值（P/N）≥2.1 时，结果为阳性； 当 1.5≤P/N＜2.1 时，结果可疑；P/N＜1.5 时，结果为阴性.将结果用Excel绘制成折线图.

2 结果与分析

2.1 F1基因序列优化结果

密码子优化结果见图1，更多的红色密码子意味着更适合宿主密码子偏好，将有更高的表达效率.优化序列提高了GC含量，消除了不利的峰，满足了目标宿主密码子适应指数（codon adaptation index，CAI）的最高表达谱，使最终的蛋白表达效率大大提升.

图1 序列优化前后对比图Fig.1 Sequences before and after optimization

2.2 F1基因的扩增及重组质粒的构建

扩增F1基因得到与预期大小一致的片段，约为699 bp（图2A）；分别以F1基因（上、下游）、T7（上、下游）、F1的上游＋T7的下游、T7的上游＋F1的下游为扩增引物，进行 PCR 鉴定，在699、1400、778、1320 bp处能看到特异性条带（图1B）；对重组质粒进行单、双酶切，单酶切的条带位置低于无酶切的重组质粒，在双酶切质粒750 bp的位置能明显看到F1的片段大小（图1C），表明F1基因已成功连接至载体.

图2 F1基因的扩增及重组质粒的鉴定Fig.2 Amplification of F1 gene and identification of recombinant plasmid

2.3 密码子优化前后的诱导效率

F1基因序列未优化组和优化组同时做以下处理：吸取诱导后的菌液离心，蛋白变性，煮沸后进行SDSPAGE电泳，结果如图3所示.在45 ku位置附近能明显看到F1基因序列优化后的蛋白表达量比未优化的蛋白表达量多，且条带较粗.

图3 SDS-PAGE电泳结果Fig.3 Electrophoresis results of SDS-PAGE

2.4 诱导条件的优化结果

保持温度和时间不变，IPTG浓度为0.3 mmol·L-1时，蛋白条带最粗（图4A）；保持浓度和时间不变，在37℃下，蛋白条带最粗（图4B）；保持浓度、温度不变，诱导时间为5 h时，蛋白条带最粗（图4C）.

图4 诱导条件的优化结果Fig.4 Optimized expression under induced conditions

2.5 重组蛋白纯化结果

向层析柱中依次加入不同浓度的咪唑对目的蛋白进行洗脱，结果发现，当咪唑浓度为80 mmol·L-1时，蛋白条带量适当，且条带单一、无杂带，洗脱效果最好（图5）.

图5 蛋白纯化结果Fig.5 Result of protein purification

2.6 多克隆抗体的Western blot鉴定及血清效价测定

于兔子心脏采血，收集血清并作为一抗，以未注射F1蛋白的兔子血清作为阴性对照，Western blot鉴定结果如图6A所示.在45 ku位置附近能孵育出目的蛋白，说明本试验已成功制备了F1蛋白的多克隆抗体.间接ELISA检测发现，F1基因的抗体效价可达1∶1024000（图6B）.

图6 多克隆抗体的鉴定及其血清效价Fig.6 Identification of polyclonal antibodies and serum titer

3 讨论

当前，越来越多的FAdV-4被发现，而针对FAdV的研究大多集中在分子结构方面，其主要结构蛋白的研究多数集中在hexon基因、penton基因以及fiber2蛋白，对F1蛋白的研究相对较少.已有研究证实，hexon基因主要作为种属的鉴定[12]，penton基因可以切断病毒和宿主之间的联系[13]，fiber2则是在病毒复制过程中起作用；F1也参与病毒感染，但具体的机制尚不明确.目前，有关FAdV-4 F1的原核表达及其多克隆抗体制备还没有详细报告，仅有FAdV 8b纤突蛋白制备的多抗[14].本研究对FAdV-4 F1基因序列进行了优化，获得的F1基因的蛋白表达量明显高于优化前F1基因的蛋白表达量；用高表达的F1蛋白制备的多克隆抗体血清效价高达1∶1024000，说明获得的抗体血清具有很好的效价水平；Western blot鉴定表明，本试验制备的FAdV-4 F1蛋白的多克隆抗体具有良好的特异性.

每个生物体或基因都存在优势密码子和弱势密码子，关于密码子的使用已有研究[15].张相民等[16]和范学政等[17]分别对痘苗病毒中的gag基因和猪瘟病毒E2基因的密码子进行了改造，获得了较高的蛋白表达量.本试验也对FAdV-4 F1基因的密码子进行了优化，将优化过的目的基因转化至表达感受态细胞中，所得的蛋白表达量较未优化的蛋白多，用纯化后的蛋白制备的多抗的效价也更高.可见，密码子的优化有利于生物体将自身的弱势转变为优势，增强其功能，促进其发展.