传统食品酸粥的发酵工艺

秦慧彬，黄志伟，张志强，张茜茜，李东航，乔治军，杨洪江*

1(天津科技大学 生物工程学院，工业微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津，300457)2(山西省农业科学院 农作物品种资源研究所，农业部黄土高原基因资源与种质创制重点实验室，杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太原，030001)

谷物发酵食品是通过各种天然发酵过程，由乳酸菌、酵母等有益微生物对稻类、麦类、豆菽类以及薯类等原料进行发酵，使其营养成分发生改变并产生独特风味的食品。与原料直接烹饪的食物相比，谷物发酵食品不仅增加了食物的保质期，而且通常更加可口、易消化，并且富含各种营养成分，如维生素、有机酸和自由氨基酸等[1]。谷物发酵食品按照发酵过程可以分为酒精型发酵和有机酸型发酵。酵母是酒精型发酵过程中的主要微生物，代表性发酵产品有米酒、黄酒、白酒、啤酒等各种酒类。有机酸型发酵包含乳酸发酵和乙酸发酵。乳酸发酵产品包括发酵的牛奶和谷物，主要微生物为乳酸菌。醋酸菌也是重要的食品微生物，在氧气过剩的条件下，醋酸菌可以将乙醇转化为乙酸，代表性发酵产品有食醋等[2]。

酸粥是我国西北地区传统的有机酸型发酵食品，由糜米为主要原料自然发酵而成，在当地被作为清凉解暑的佳品，具有较大的市场发展潜力。但是，酸粥制作一般在家庭中完成，没有形成规模化生产，存在着一定的安全风险。在先前的研究中，采集了59份山西省河曲县和偏关县的家庭自制的酸粥样品，对酸粥中的乳酸、乙酸和自由氨基酸进行了测定，结合微生物分离方法与宏基因组测序技术，对酸粥中微生物菌群的多样性进行了系统分析，明确了酸粥中主要微生物种类和丰度；并从中分离鉴定了多株乳酸菌、醋酸菌和酵母[3]。乳酸菌是酸粥发酵的主要菌种。

国内有研究人员先后从各种酸粥样品中分离了多种乳酸菌，并对分离菌株的性质特别是抑菌活性进行了分析[4-8]。乳酸菌在肠道中的定殖能力与其合成生物被膜的能力具有相关性，生物被膜量越多，乳酸菌定殖肠道比例越高。在自然界中，微生物通过形成生物被膜，抵御包括极端温度、pH、渗透压、营养损耗等多种环境压力，增加生存的几率。在体内，形成生物被膜的细菌能够免遭免疫或药物清除[9]。益生菌具有在肠道中良好的定殖能力，研究表明微生物合成生物被膜的水平与其在肠道的定殖能力呈正相关性[10]。据此，本研究将乳酸菌合成生物被膜的水平作为选择发酵菌株的重要标准。通过分析来自酸粥的乳酸菌菌株生产生物被膜能力、耐酸性、耐高温和抑菌性，从210株乳酸菌菌株中选择1株表现优异的戊糖乳杆菌(L.pentosus)h8-c作为出发菌株进行实验室酸粥的发酵工艺研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵菌株分离自山西省忻州市河曲县的酸粥样品，包括戊糖乳杆菌(L.pentosus)h8-c、库兹威尔毕赤酵母(P.kudriavzevii)h8-a和醋酸菌(A.lavaniensis)h8-b，均保存于山西省农业科学院农作物品种资源研究所微生物实验室。实验所用糜米为河曲县主要地方品种“白糜子”，大米、小米购于当地超市；YEPD[11]、GYC[12]、MRS[13]培养基、BHI[14]培养基按照文献所述进行配制。“AccQ-Fluor”试剂，美国Waters公司，氨基酸混合标准品AAS18和色氨酸标准品A9906，美国Sigma-Aldrich有限公司。

1.2 仪器与设备

5804R低温高速离心机，德国eppendorf公司；dragonlab MX-S漩涡振荡器，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司；HYQ60气浴恒温振荡器，武汉汇诚生物科技有限公司；MIR-554生化培养箱，日本三洋公司；SX-500高压灭菌器，日本TOMY公司；SW-CJ-2FD无菌操作台，苏州苏洁净化设备有限公司；Directq-3纯水机，美国Millipore公司；Synergy H1酶标仪，美国BIOTEK公司；PB-10 pH计，德国赛多利斯科技仪器有限公司；SBA-40D生物传感仪，济南柏盛生物科技有限公司；超高效液相色谱仪(配有PDA检测器)，美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌h8-c生长曲线的绘制

将戊糖乳杆菌h8-c单菌落接入MRS液体培养基中，30 ℃静置培养12 h后。以3%接种量转接至96微孔板中，每孔MRS培养基体积为250 μL。30 ℃静置培养48 h，每10 min测定其OD600吸光度值，并绘制乳酸菌的生长曲线。

1.3.2 接种量对糜米发酵的影响

在MRS液体培养基中，30 ℃静置培养菌株h8-c至对数期，6 000 r/min离心5 min，弃上清，使用生理盐水重悬菌体，并调解菌体浓度至OD600为0.6～0.8作为发酵种子。称取100 g淘洗晾干后的糜米放于1 L试剂瓶中，加入900 mL无菌水。将上述菌悬液作为种子转接入糜米混合液中，接种量分别为1%、3%、5%、7%和9%，分别加入适量的无菌水，使糜米悬液的总体积均为1 L，每个接种量设置3个平行。

转接后取初始发酵液20 mL，其中1 mL发酵液用于系列稀释，涂布平板确定菌体数量，剩余发酵液经过滤后用于测定乳酸含量。发酵过程中，每隔24 h取出20 mL发酵液用于确定菌浓和乳酸含量。乳酸含量使用生物传感仪进行测定[3]。

1.3.3 糜米乳酸菌发酵的工艺优化

发酵菌株为h8-c，原料为糜米，30 ℃持续发酵72 h，每隔24 h取20 mL发酵液用于测定乳酸、自由氨基酸含量，并对酸粥进行感官评价，同时每24 h将糜米换1次。发酵前采用不同方式处理糜米，包括：(A)糜米放入试剂瓶中，不做任何处理；(B)糜米放入试剂瓶中，加入400 mL无菌水，65 ℃水浴30 min；(C)糜米放入试剂瓶中，105 ℃处理15 min；(D)糜米加适量无菌水，煮沸15 min。发酵工艺如下：

糜米100 g→淘洗→沥干→A/B/C/D处理→冷却→加水至1 000 mL→接种发酵(每24 h换相同处理的糜米)72 h→每24 h取发酵液定量分析乳酸和自由氨基酸含量

氨基酸含量测定使用AQC柱前衍生反相超高效液相色谱法进行定量分析[3]。

1.3.4 不同谷物的乳酸菌发酵

发酵菌株为h8-c，原料分别为大米、小米、糜米、大米和小米(质量比1∶1)、大米和糜米(质量比1∶1)、小米和糜米(质量比1∶1)。30 ℃持续发酵48 h，每隔24 h取10 mL发酵液用于测定自由氨基酸含量，并进行感官评价。发酵工艺如下：

原料米20 g→淘洗→沥干→加水至200 mL→接种发酵48 h→取发酵液定量分析氨基酸含量

1.3.5 乳酸菌、醋酸菌、酵母菌混合发酵

分别利用YEPD、GYC和MRS液体培养基，培养毕赤酵母h8-a、醋酸菌h8-b和戊糖乳杆菌h8-c至OD600值达到0.6～0.8，6 000 r/min离心5 min，弃上清，以相同体积的生理盐水重悬细菌。菌悬液作为种子以1%接种量转接至糜米中，30 ℃持续发酵48 h，每隔4 h取20 mL发酵液用于测定乳酸、自由氨基酸含量，并进行感官评价，发酵24 h时换米。发酵工艺如下：

糜米100 g→淘洗→沥干→加水至1 000 mL→接种发酵48 h(发酵24 h时换米)→每4 h取发酵液定量分析菌体数量、乳酸含量和氨基酸含量

1.3.6 感官评价

选取不同年龄阶段的品评人员10人，对酸粥样品进行评分，包括成品的风味、口感、色泽和外观结构4个方面[15]。

2 结果与分析

2.1 戊糖乳杆菌h8-c的生长曲线

本研究定量分析了210株乳酸菌分离菌株合成的生物被膜，发现戊糖乳杆菌h8-c合成生物被膜的水平最高，约为其他菌株平均水平的10倍。并且该菌株在耐酸性、耐高温和抑菌性方面都表现很好。通过分析该菌株的生长曲线，发现h8-c菌株在MRS培养基中延迟期较短，2 h后即进入对数生长期，具有较快的生长速度(图1)。菌株h8-c被选择为发酵菌株，在实验室进行酸粥发酵的工艺研究。

图1 戊糖乳杆菌h8-c的生长曲线Fig.1 The growth curve of Lactobacillus pentose h8-c

2.2 乳酸菌接种量对发酵过程的影响

培养菌株h8-c以不同接种量转接入糜米中，分析乳酸菌数量和乳酸含量的变化。使用SPSS 18.0软件对相同发酵时间不同接种量进行发酵的菌体数量进行一阶方差分析，在5%显著水平条件下，发酵起始阶段(0 h)，以5%和7%接菌量进行发酵的菌体数量差异不显著，其余接种量两两之间相互比较菌体数量均有显著差异，而发酵24、48和72 h时，使用不同接菌量发酵的菌体数量之间均无显著差异(图2-a)。在发酵过程中，随着发酵时间的延长乳酸含量不断增长，发酵0～24 h乳酸含量增长最多。使用方差分析表明，以不同接菌量进行发酵实验，在发酵0 h，以5%和7%接菌量进行发酵，乳酸含量差异不显著，其余接菌量乳酸含量差异显著。发酵24和48 h时，7%接菌量与其他接菌量发酵乳酸含量差异显著，其余接菌量发酵的乳酸含量差异不显著，在发酵72 h时，所有接菌量发酵产生的乳酸含量差异不显著(图2-b)。根据以上结果分析，使用1%的接菌量进行后续实验，对应的初始菌体数量为(7.06±0.05)lgCFU/mL，发酵72 h后菌浓为(7.65±0.20)lgCFU/mL；发酵初始的乳酸含量为(3.33±2.36)μg/mL，发酵72 h后乳酸含量增加到(166.67±4.71)μg/mL。

a-菌株h8-c在酸粥发酵中的数量变化；b-不同接菌量发酵液中乳酸含量的变化图2 接种量对酸粥发酵的影响Fig.2 Effects of inoculum size effects on Suanzhou fermentations

2.3 糜米处理方式对酸粥发酵的影响

对糜米发酵前处理分别采用生米不处理、65 ℃水浴处理30 min、105 ℃处理15 min或100 ℃煮沸处理15 min四种方式。发酵结果如图3所示。

a-四种不同处理的糜米对乳酸含量的影响；b-四种不同处理的糜米对自由氨基酸含量的影响A-生米发酵；B-65 ℃水浴处理30 min；C-105 ℃处理15 min；D-100 ℃煮沸处理15 min图3 糜米处理方式对酸粥发酵的影响Fig.3 Treatment effects of proso millet on the Suanzhou fermentations

在发酵过程中，4种不同的处理方法都表现为发酵24 h乳酸含量明显增加，发酵24 h后乳酸含量增加不明显。糜米发酵前经65 ℃水浴30 min处理的情况下，乳酸含量最高。生米发酵液自由氨基酸含量最高，且随着发酵时间的延长不断增加。而经过高压灭菌或煮沸处理的糜米再通过发酵过程会影响自由氨基酸的生成。感官评价结果显示，以1%接菌量进行生米发酵48 h的酸粥风味最佳，酸度适口；发酵72 h后，颗粒完整、酸汤色泽成乳白色、酸香味浓郁；经过水浴、高压或煮沸处理后，糜米颗粒有不同程度的破损，高压和蒸煮后的糜米颗粒破损严重，酸汤较浑浊。所以，在乳酸菌发酵酸粥的工艺路线中，仍然应该选择生米发酵的路线，发酵48 h时自由氨基酸含量较高，达到177.23 μg/mL。

2.4 菌株h8-c发酵不同的谷物

以乳酸菌h8-c为发酵菌株，对不同谷物进行酸粥发酵研究。酸粥发酵使用的不同谷物或组合，包括：大米、小米、糜米、大米小米1∶1混合、大米糜米1∶1混合、小米糜米1∶1混合。

实验结果显示，发酵48 h后，单种谷物发酵酸粥产生总的自由氨基酸和必需氨基酸的能力由大到小：小米>大米>糜米，混合发酵酸粥中大米与小米的组合自由氨基酸含量最高(图4)。小米发酵酸粥在氨基酸含量和各种氨基酸分布上都表现优良，而糜米则在短时间纯菌发酵中的表现并不太好，这与传统老汤发酵中乳酸、自由氨基酸含量不断积累的情况不同。酸粥中丙氨酸含量在所有氨基酸含量中最高，或许与酸粥特有的风味有关。

a-不同原材料乳酸菌发酵自由氨基酸总量发酵前后变化；b-不同原材料乳酸菌发酵必需氨基酸总量发酵前后变化；c-不同原材料乳酸菌发酵丙氨酸含量发酵前后变化图4 不同谷物原料对酸粥发酵的影响Fig.4 Characterization of Suanzhou products fermented with different cereals

2.5 混菌发酵糜米酸粥

为了分析醋酸菌和酵母菌对酸粥发酵的影响，选择了乳酸菌h8-c、醋酸菌h8-b和酵母菌h8-a作为发酵菌株进行混菌发酵，原料为糜米生米，与自然发酵相似，发酵周期为48 h。

酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的初始菌数分别为(4.35±0.06)lg CFU/mL,(5.02±0.02)lg CFU/mL,(5.38±0.07)lg CFU/mL。绘制发酵48 h的生长曲线，从图5-a可以看出，酵母在生长初期菌体生长速度较快，发酵12 h酵母数量为发酵0 h的10倍，而发酵12～24 h阶段，酵母数量维持稳定，数量平均在(5.71±0.07)lg CFU/mL，发酵24～48 h，酵母菌的数量呈缓慢下降趋势。醋酸菌在发酵的前12 h菌体数量没有明显增长，平均维持在(4.95±0.13)lg CFU/mL，在发酵12～48 h，醋酸菌数量缓慢增长，从(5.67±0.12)lg CFU/mL增长到(6.47±0.15)lg CFU/mL。乳酸菌在发酵48 h过程中持续增长，发酵48 h时，乳酸菌的菌体数量为(8.09±0.16)lg CFU/mL。

总体来看，发酵过程中占主导优势的菌株为乳酸菌，菌体数量占优势地位。在发酵过程的前12 h，由于醋酸菌生长缓慢，对乳酸菌和酵母菌没有抑制作用，乳酸菌和酵母菌的增长速度比较快，且乳酸菌和酵母菌之间表现出协同增长的趋势。发酵12 h后，当醋酸菌生长速率提高时，乳酸菌和酵母菌的生长速率受到不同程度的抑制，乳酸菌表现出生长缓慢，酵母菌的数量则开始下降。

在发酵过程中，氨基酸含量随着发酵时间的延长持续增加，发酵48 h后，总的氨基酸质量浓度达到48 μg/mL，乳酸质量浓度达到1 750 μg/mL。在自由氨基酸中丙氨酸含量尤为突出，发酵48 h后达到13 μg/mL，占总的氨基酸含量的27%。生米混菌发酵48 h后，糜米颗粒较完整，酸汤呈淡乳白色，酸香味较纯乳酸菌发酵略淡，口味没有明显差别。

3 结论

本研究分别以乳酸、自由氨基酸和感官评价得分为综合评价指标，对不同原料和不同工艺发酵的酸粥产品进行了分析。本研究结果显示，在多种酸粥产品中，单一乳酸菌发酵酸粥的生产工艺以生米发酵为最优，发酵48 h可以达到口味最佳；以不同原材料发酵酸粥，以小米表现为最优，未来开发快速发酵酸粥工业产品，应该考虑以小米为主的混合谷物进行发酵酸粥。混合菌株发酵酸粥，成品酸香味略淡，感官评价得分与纯菌发酵没有显著差异，该结果与其他科研人员研究结果相似[15-16]。在未来的研究中，还将研发可直接食用的酸粥产品，该产品富含活的乳酸菌，可以作为益生菌定殖人体肠道，发挥益生作用。

a-混菌糜米发酵微生物数量变化；b-混菌糜米发酵乳酸含量变化;c-混菌糜米发酵氨基酸总量变化；d-混菌糜米发酵丙氨酸总量变化图5 混合菌株发酵糜米对酸粥的影响Fig.5 Characterization of Suanzhou products fermented with mixed starting strains from proso millet