甲状腺细针穿刺吸取细胞学标本中miR-221与miR-222对良恶性甲状腺结节的诊断价值研究

闫永鑫，徐宁，王国凤*

甲状腺结节的发病率逐年升高，总发病率为19%～46%，其中恶性结节占5.0%～15.0%，超声引导下甲状腺细针穿刺活检（US-FNAB）联合病理学检查是筛查和早期诊断甲状腺癌的有效方法，但仍存在一部分无法确诊的病例［1]。而这部分无法确诊的甲状腺结节患者术后多为良性，恶性率仅占1.7%～11.3%［2]。因此，为避免增加此类患者的手术风险及经济负担，积极寻找可靠、可行的检测指标来鉴别甲状腺结节的良恶性以及评估其恶性程度是目前甲状腺结节研究中迫切需要解决的问题。为提高甲状腺术前诊断的准确性，近年来许多研究聚焦于早期诊断预警指标，其中微小RNA（miRNAs）是研究的热点之一［3-4]。已有研究发现，miRNAs表达水平有助于提高术前诊断率及评估肿瘤恶性程度等［5]。可将肿瘤组织中异常表达的miRNAs作为甲状腺乳头状癌的新型肿瘤标志物，但获取组织标本具有较大创伤性，同时术后常规标本检测miRNAs常具有滞后性［6]。因此，国内外学者开始关注外周血和细针穿刺吸取细胞学（FNAC）检查中miRNAs在甲状腺结节诊断中的价值［7-9]。为进一步探讨miRNAs作为早期诊断甲状腺癌生物学标志物的可行性，本研究观察甲状腺FNAC检查标本中miR-221、miR-222表达水平，并分析其对甲状腺结节的诊断价值，以期明确甲状腺FNAC检查标本中miR-221、miR-222表达水平的分子学价值。

国内外文献研究现状：

已有研究发现，微小RNA（miRNAs）表达水平有助于提高术前诊断率及评估肿瘤恶性程度等，但获取组织标本具有较大创伤性，而术后常规标本检测miRNAs则常具有滞后性。因此，国内外学者开始关注外周血和细针穿刺miRNAs在甲状腺结节诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年3月—2017年12月就诊于南京医科大学康达学院第一附属医院符合研究标准的甲状腺结节患者60例。排除标准：冠心病、高血压、糖尿病、肾病、自身免疫疾病、凝血功能障碍者。患者均经甲状腺FNAC检查，并依据甲状腺FNAB的细胞学分类（贝塞斯达系统）［10]得出恶性病变17例，良性病变34例，可疑恶性、未诊断病变5例，2例滤泡性病变，2例滤泡性肿瘤。本研究经连云港市第一人民医院伦理委员会批准，患者均对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集 收集患者性别、年龄、肿瘤最大直径、病灶数量、包膜侵犯、淋巴结转移、TNM分期情况。

1.2.2 甲状腺FNAC检查 患者均在超声引导下行FNAB检查，对于多发结节，选择超声恶性征象最多的结节为穿刺结节，采用10 ml细针穿刺负压吸引器连接7号针头进行抽吸，并将抽吸物注于载玻片上进行检测。注射器内剩余的穿刺物用0.9%氯化钠溶液反复洗涤后置于离心管中，1600 r/min离心30 min（离心半径8 cm）后弃上清液，将700 μl Qizol加入细胞中混匀，置于-80 ℃冰箱冻存备用。

FNAB检查结果参照美国国家癌症研究提出的贝塞斯达系统进行诊断［10]。

1.2.3 PCR法检测miR-221、miR-221表达水平 将冰箱冻存备用的细胞液取出，参照陈晓敏等［9]的具体操作方法，采用PCR法检测miR-221、miR-221表达水平。采用2-ΔΔCt法对数据进行统计分析。

1.2.4 金标准 以甲状腺术后病理检查结果为诊断良、恶性甲状腺结节的金标准。

1.3 统计学方法 采用SPSS 24.0统计学软件进行分析数据分析。所有统计学指标经过正态性检验，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，两组间比较采用成组t检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验；绘制甲状腺FNAC检查标本中miR-221、miR-222诊断恶性甲状腺结节的受试者工作特征曲线（ROC曲线），并计算ROC曲线下面积（AUC）、灵敏度、特异度、约登指数。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者甲状腺术后病理结果 60例患者经甲状腺术后病理检查示，良性结节51例，恶性结节9例。

2.2 良性结节与恶性结节患者FANC检查中miR-221、miR-222表达水平比较 恶性结节患者FANC检查中miR-221、miR-222表达水平高于良性结节患者，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 良性结节与恶性结节患者甲状腺FANC检查中miR-221、miR-222表达水平比较（±s）Table 1 Comparison of the expression levels of miR-221 and miR-222 in FANC with benign and malignant thyriod nodules

表1 良性结节与恶性结节患者甲状腺FANC检查中miR-221、miR-222表达水平比较（±s）Table 1 Comparison of the expression levels of miR-221 and miR-222 in FANC with benign and malignant thyriod nodules

分类 例数 miR-221 miR-222恶性结节 483.33±0.933.42±0.84良性结节 92.54±0.432.63±0.05 t值 5.906.41 P 值 ＜0.01 ＜0.01

2.3 甲状腺FNAC检查标本中miR-221、miR-222对甲状腺恶性结节的诊断价值 甲状腺FNAC检查标本中miR-221诊断甲状腺恶性结节的AUC为0.774（0.691，0.858），其最佳截断值为2.77，灵敏度为80.0%，特异度为60.0%，约登指数为0.400。甲状腺FNAC检查标本中miR-222诊断甲状腺恶性结节的AUC为0.759（0.672，0.845），其最佳截断值为2.73，灵敏度为76.7%，特异度为66.7%，约登指数为0.44（见图1）。

图1 甲状腺FNAC检查标本中miR-221、miR-222诊断恶性甲状腺结节的ROC曲线Figure 1 ROC curves of miR-221 and miR-222 in thyroid nodule FNAC examination specimens for diagnosis of malignant thyroid nodules

2.4 甲状腺FNAC检查结果联合甲状腺FNAC检查标本中miR-221、miR-222诊断甲状腺结节的符合率 术后病理检查结果良性51例、恶性9例。甲状腺FNAC检查结果联合甲状腺FNAC检查标本中miR-221、miR-222诊断甲状腺结节的符合率均在70.0%以上，其中甲状腺FNAC检查结果联合甲状腺FNAC检查标本中miR-221、miR-222诊断甲状腺结节与术后病理检查结果的符合率为80.0%（见表2）。

表2 甲状腺FNAC检查结果、甲状腺FNAC检查标本中miR-221及miR-222单独与联合诊断甲状腺结节的符合率情况Table 2 Independent or combined diagnostic coincidence rate of thyriod nodules FNAC result，miR-221 and miR-222 in thyriod nodules FNAC specimens for thyroid nodules

2.5 不同患者miR-221、miR-222表达水平比较 不同性别、年龄、肿瘤最大径、病灶数量、包膜侵犯情况、淋巴结转移情况、TNM分期患者miR-221、miR-222表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表3）。

3 讨论

研究发现miRNA与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关，且在肿瘤的基因诊断、靶向治疗等方面起到了重要作用［3-5]。miR-221与miR-222是成簇的microRNAs，基因位于X染色体P11.3区约1 kb的区域内，呈同步表达，其序列在各物种间高度保守。miR-221和miR-222可以抑制细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂p27kipl的表达，促进细胞从G1期向S期的转变，进而抑制肿瘤细胞的增殖。miR-221可通过调节HOXB5基因的表达抑制细胞凋亡，高表达的miR-221和miR-222作用于关键靶基因成为甲状腺癌癌变的关键因素［11-18]。研究证明，miR-221和miR-222在PTC、滤泡性乳头状癌、滤泡性肿瘤、甲状腺滤泡性腺瘤中的表达升高［14]。且值得注意的是，miR-221与miR-222是在PTC中高表达最恒定的miRNA，在未分化甲状腺癌（ATC）中也明显上调，而在滤泡性腺瘤与增生性结节中却没有发现上调［15]。因此，miR-221、miR-222在甲状腺癌组织中具有特异性表达，组织标本中的miRNAs异常表达可用于对甲状腺结节的早期筛查和诊断。

表3 不同患者miR-221、miR-222表达水平比较（±s）Table 3 Comparison of the levels of miR-221，miR-222in different patients

表3 不同患者miR-221、miR-222表达水平比较（±s）Table 3 Comparison of the levels of miR-221，miR-222in different patients

项目 例数 miR-221 t值 P值 miR-222 t值 P值性别男 273.16±1.241.19 ＞0.053.05±0.861.04 ＞0.05女 332.98±2.032.78±0.75年龄（岁）＜45293.89±1.021.10 ＞0.053.02±0.711.02 ＞0.05≥45312.87±1.892.56±0.79肿瘤最大直径（cm）＜1 283.02±1.121.46 ＞0.051.98±0.76-1.47 ＞0.05≥1323.01±0.983.40±1.86病灶数量单发 322.98±1.23 -0.93 ＞0.053.41±1.280.94 ＞0.05多发 283.12±1.082.11±0.66包膜侵犯否 343.67±2.320.42 ＞0.052.18±0.78-0.38 ＞0.05是 262.79±0.763.53±1.32淋巴接转移否 333.12±2.130.59 ＞0.052.13±0.46-0.29 ＞0.05是 272.65±1.563.62±2.12 TNM分期Ⅰ+Ⅱ 353.79±1.031.93 ＞0.052.45±0.62-0.11 ＞0.05Ⅲ+Ⅳ 252.74±2.023.62±1.48

虽然肿瘤组织中的miRNAs可以作为一种新的、有前景的肿瘤标志物，但是，为了获得肿瘤组织的miRNAs，进行有创手术显然不适用于广泛的临床应用，而甲状腺FNAC可以改善这种情况，其微创获取标本，或许可以为早期诊断提供帮助。已有研究表明，甲状腺FNAC检查标本中miRNA或许在甲状腺肿瘤诊断中具有潜在的应用价值［19-21]。为此，本研究通过甲状腺FNAC检查获取标本，采用PCR法检测标本中miR-221、miR-222表达水平，并探讨其是否可作为诊断甲状腺癌的分子生物标志物。本研究结果显示，恶性甲状腺结节患者甲状腺FNAC检查标本中miR-221、miR-222表达水平明显高于良性结节患者，但绘制ROC发现，二者分别诊断恶性甲状腺结节的灵敏度和特异度并未超过95%，提示单独的miR-221、miR-222尚不能用于作为诊断恶性甲状腺结节的生物学标志物。进一步分析发现，甲状腺FNAC检查联合miR-221、miR-222可以提高对甲状腺结节诊断的符合率。但本研究仍存在样本量有限等不足，因此结果的实际应用价值有待于更大样本的多中心研究进一步证实。

综上所述，恶性甲状腺患者甲状腺FNAC检查标本中miR-221、miR-222表达水平明显升高，其目前不适于单独鉴别良恶性甲状腺结节，但联合甲状腺FNAC检查结果可以提高对良恶性甲状腺结节的诊断效能。