改则县2个牦牛遗传资源群体评估

巴多 扎西多吉 次旦卓玛 欧珠 平措占堆洛桑达瓦 朱彦宾 孙光明 洛 桑 达娃央拉 次旦央吉 巴桑旺堆 尼玛次仁 洛桑顿珠 益西吐登 周全

摘要    本研究利用18对微卫星对改则县的16头本地牦牛和18头半野血牦牛进行遗传多样性评估。结果显示，18对微卫星的平均等位基因数为7.44，其中TGLA73、BM2113和BGR3012等3个位点的观测杂合度最高，为1.000 0，AGLA293位点的观测杂合度最小，为0.204 9。改则县本地牦牛的期望杂合度（HE±SD=0.700 0±0.042 2）、观测杂合度（HO±SD=0.724 3±0.027 0）、平均等位基因数（NA=6.22±2.86）以及多态信息含量（PIC=0.636）均要高于改则县半野血牦牛（HE±SD=0.686 4±0.039 4，HO±SD=0.694 0±0.026 5，NA=6.06±2.44，PIC=0.622）。2个群体之间的遗传分化指数FST=-0.005 42，同时结合主成分分析，发现2个群体遗传分化不明显。

关键词    微卫星;遗传多样性;半野血牦牛;西藏改则

中图分类号    S823        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）16-0173-03            开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    Using 18 microsatellites，genetic diversity assessment of 16 local yak and 18 half-wild yak from Gaize County was studied.The results showed that the average number of alleles of 18 pairs of microsatellites was 7.44.The observed heterozygosity of the three loci（TGLA73，BM2113 and BGR3012）was highest（1.000 0），and the smallest observed heterozygosity of AGLA293 was 0.2049.The expected heterozygosity（HE±SD=0.700 0±0.042 2），observed heterozygosity（HO±SD=0.724 3±0.027 0），average allele number（NA=6.22±2.86）and polymorphic information content（PIC=0.636）of the local domestic yak were higher than those of the semi-wild blood yak respectly（HE±SD=0.686 4±0.039 4，HO±SD=0.694 0±0.026 5，NA=6.06±2.44，PIC=0.622）.The genetic differentiation index FST=-0.005 42 between the other two populations，combined with principal component analysis，it is found that the genetic differentiation of the two populations was not obvious.

Key words    microsatellite;genetic diversity;semi-wild blood yak;Gaize Tibet

改则县隶属西藏自治区，地处西藏西北部、阿里地区的东部、藏北高原腹地。东与那曲地区的双湖、尼玛县相接，东南与措勤县相连，南与日喀则市的仲巴县毗邻，西与革吉县、日土县接壤，北以昆仑山为界与新疆维吾尔自治区交界。东西长450 km，南北宽670 km，总面积13.56万km2，是阿里地区面积最大的一个纯牧业县，约占阿里地区总面积的1/3。

微卫星是20世纪80年代后期开发的分子标记。微卫星广泛分布在整个基因组中，富含多态性，高分辨率，相对高度保守，共显性，易于检测和重现[1-3]。微卫星技术被广泛地应用于猪[4-7]、牛[8-12]和羊[13-16]的遺传资源鉴定工作中。微卫星标记在牦牛中也得到了应用，例如，罗 辉等[17]和蔡 欣等[18]分别利用微卫星分子标记研究了麦洼牦牛的遗传多样性;钟金城等[19]利用微卫星分析标记对麦洼牦牛、九龙牦牛、大通牦牛、天祝白牦牛的遗传多样性及其分类进行研究;毛永江等[20]利用微卫星标记和血液蛋白基因坐标记方法研究青海高原牦牛内的遗传多样性;张浩[21]利用微卫星对甘肃省天祝县的5个天祝白牦牛群体进行了近交系数的研究;李 铎等[22]利用微卫星DNA研究了西藏11个牦牛类群的遗传多样性及类群间的系统进化关系。

本研究利用微卫星标记从DNA水平上对改则县的本地牦牛和半野血牦牛进行遗传多样性评估，为评价、保护和利用改则县的牦牛遗传资源提供理论依据。

1    材料与方法

选择改则县本地牦牛16头和半野血牦牛18头（表1），采集静脉血，带回实验室，于-80 ℃的冰箱中保存备用。用基因组DNA提取试剂盒（DP304，天根生化科技有限公司）提取全血中的基因组DNA，-20 ℃保存。

参考联合国粮农组织（FAO）和国际动物遗传学会（ISAG）联合推荐的引物，本研究选取了其中18对SSR引物，并在引物序列上游5′端加上FAM等荧光标记，以便检测。将引物进行组合扩增，并对PCR过程进行优化，荧光标记，获得PCR产物。所用引物和片段大小见表2。采用20 μL PCR反应体系，其中各组分的终浓度分别为dNTPs 0.2 mmol/L、Mg2+1.5 mmol/L、混合上下游引物0.5 mmol/L、Taq酶5 U/μL、DNA模板1 μL（约60 ng）。PCR反应程序为94 ℃ 预变性5 min;94 ℃变性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，经过35个循环;于72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测分析。PCR产物用ABI 3130 xl全自动基因分析仪进行分型检测。

利用以下软件分析数据：Microsatellite Toolkit软件[23]计算各遗传位点的等位基因数（Number of alleles，NA）、多态信息含量（Polymorphic information content，PIC）、观察杂合度（Ob-served Heterozygosity，HO）和期望杂合度（Expected He-terozygosity，HE）等参数;Arlequin 3.5软件[24]计算物种内群体间遗传分化指数（FST）;GENEPOP 3.4软件[25]进行哈德温伯格平衡检验（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）;Fstat 2.9软件[26]计算群体近交系数（FIS）;主成分分析（PCA）利用R语言脚本分析。

2    结果与分析

由表3可知，就位点而言，18个微卫星中AGLA293位点的期望杂合度（HE=0.193 7）、观测杂合度（HO=0.204 9）以及多态信息含量（PIC=0.177 9）均是最小的。TGLA122位点的期望杂合度（HE=0.912 5）最大;有3个位点（TGLA73、BM-2113和BGR3012）的观测杂合度最大，为1.000 0;TGLA122位点的PIC值最大，为0.868 8。18个微卫星中平均发现了7.44个等位基因数，等位基因数范围3（BM2113）～14（TGLA-122）。18个微卫星中只有6个位点在这2个牦牛群体中偏离了哈代温伯格平衡，其中SPS115和BGR3020位点只在一个牦牛群体中偏离了哈代温伯格平衡，MGTG7、BM2113、BGR3019和BGR3012这4个位点在2个牦牛群体中均偏离了哈代温伯格平衡。

在2个改则县牦牛群体的34个个体的18个微卫星中共发现了134个等位基因数，平均等位基因数为7.44。本研究选取的18个微卫星位点中，BGR3011位点为中度多态，AGLA293位点为低度多态，其余16个位点均为高度多态。说明2个牦牛群体遗传多样性水平较高，均有足够的基因资源存在于牦牛群体内。并且18个微卫星位点中有10个位点的观测杂合度大于期望杂合度，其中有3个位点的观测杂合度为1.000 0，这也说明了2个牦牛群体中的遗传多样性水平较高。

就群体而言，改则县本地牦牛内的期望杂合度（HE±SD=0.700 0±0.042 2）、观测杂合度（HO±SD =0.724 3±0.027 0）、平均等位基因数（NA=6.22±2.86）以及多态信息含量（PIC=0.636）均要高于改则县半野血牦牛（HE±SD=0.686 4±0.039 4，HO±SD=0.694 0±0.026 5，NA=6.06±2.44，PIC=0.622），2个群体的观测杂合度均要高于期望杂合度。近交系数在2个群体中均为负值，说明这2个牦牛群体均表现为杂合子过度。2个牦牛群体中都各有5个微卫星位点偏离了哈代温伯格平衡。然而根据遗传多样性各项参数综合考量，这2个群体遗传多样性尚表现丰富，暗示2个群体保种情况良好，具有进一步开发利用的潜力。

此外，改则县本地牦牛品种与半野血牦牛之间的的多样性指标数值相差不大，说明2个群体之间差异性可能很小（表4），进一步计算2个群体间间遗传分歧（FST值），结果显示FST值为-0.005 42，差异不显著（P>0.05），进一步表明了2个群体间的差异性较小。同时PCA分析结果（图1）显示，2个群体存在大量个体间表现高度亲缘相近，这可能暗示了由于两者栖息地较近，在放牧过程中可能存在频繁的基因交流，或认为的串换种畜所致[27]。

3    结论

评估结果表明，改则县2个牦牛群体中的遗传多样性水平较高，且遗传分化不明显。

4    参考文献

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