不同动物宿主感染卫氏并殖吸虫后的抗体动态变化

章乐生 王旗 李清越 张世清 杨荣笙 呼明闯 黄建国 汪天平*

肺吸虫病是由并殖吸虫感染引起的一种重要的人兽共患食源性寄生虫病[1]，流行于亚洲、非洲和美洲等25个国家或地区。目前全球已报道的并殖吸虫有50余种[2]，在我国寄生于人体的并殖吸虫主要有卫氏并殖吸虫和斯氏并殖吸虫[3]。其中卫氏并殖吸虫发现较早，分布广泛，是人体最主要的致病虫种。依据卫氏并殖吸虫囊蚴在体内是否发育成为成虫并产卵，可将宿主动物分为适宜和非适宜宿主[4]。本实验拟用卫氏并殖吸虫囊蚴感染适宜宿主犬和非适宜宿主大鼠，并以卫氏并殖吸虫成虫抗原为探针，检测适宜和非适宜宿主感染后的抗体，观察抗体水平动态变化情况。

材料与方法

一、卫氏并殖吸虫囊蚴获取

从肺吸虫病历史流行区安徽休宁县蓝田镇采集溪蟹，将溪蟹捣碎后其碎渣倒入20目、40目、60目的三层网筛中，并用清水冲洗过筛；40目网筛及60目网筛中的细渣用清水冲入锥形量杯中，自然沉淀3～5 min，待上层水基本澄清后，轻轻弃去上层肉屑；锥形量杯中再次加入适量的清水，同样自然沉淀，重复3～5次；锥形量杯中最后一次沉淀物倒入培养皿中，解剖镜下观察并挑取囊蚴，并在显微镜下进行鉴定。

二、动物感染与血清收集

家犬(市购)4只，体重约10 kg，实验前经改良加藤法对粪便进行病原学检查，均未发现寄生虫虫卵，经口灌服阿苯达唑预防性驱虫治疗(剂量：每只犬0.2 g/d，连续2 d)后，每只犬感染囊蚴100只，于犬下肢静脉收集1～3号犬感染前和感染后1～16周的血清，4号犬感染84 d后解剖取成虫。

SD大鼠6只(购自合肥史文斯试验用品销售部)，随机分配为感染组和对照组(每组各3只)；感染组每只大鼠口饲法感染囊蚴20只，对照组不予感染；于感染前和感染后1～16周收集大鼠尾末梢血清。

三、成虫收集及抗原提取

4号犬囊蚴感染84 d后，解剖，从肺中分离出肺吸虫成虫，用0.9%生理盐水洗净后挑取虫体。加入0.01%硫柳汞生理盐水，并用组织研磨器进行研磨处理。冻融3 d，每天2次，低温离心10 000 g 30 min后取上清，即为成虫可溶性抗原，BCA测定蛋白含量为9 μg/μl。

四、ELISA体系建立及抗体检测

将卫氏并殖吸虫成虫可溶性抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释为10 μg/ml，包被96孔酶标板，每孔加抗原液100 μl，4℃过夜；PBST洗涤2次后用5%脱脂奶粉于37℃水浴箱封闭1 h，每孔加封闭液300 μl；再用PBST洗涤2次，加入经pH 7.2 PBS稀释后的待测血清，每孔100 μl，犬、鼠血清分别按1∶100、1∶3200稀释，同时设空白对照(加稀释液100 μl)，阴性对照(100 μl未感染的犬、鼠血清)；加样后酶标板置于37℃水浴箱孵育30 min，再用PBST洗涤3次后，每孔加入100 μl稀释后的酶标二抗，其中二抗分别为羊抗狗IgG(Abcom公司，货号：ab112840)和兔抗鼠IgG(上海生工，货号：D110098-0100)，犬、鼠二抗分别按1∶50 000、1∶1 000稀释；37℃水浴箱孵育30 min后，PBST洗涤3次，加入100 μl TMB室温避光显色15 min，最后加入50 μl 2mol/L H2SO4终止反应，双波长测定OD值(检测波长450 nm，参考波长630 nm)。判断标准：样本OD值/阴性对照OD值(S/N)≥2.1时，判定为阳性(犬0周血清为阴性对照，鼠的阴性对照为同时期3只对照鼠血清OD值的平均值)。

结 果

一、卫氏并殖吸虫囊蚴和成虫观察

现场采集的溪蟹经捣碎过滤和沉淀后，于解剖镜下观察并挑取囊蚴。囊蚴在解剖镜下呈乳白色球形，囊壁较厚，直径约300～400 μm，内含后尾蚴，显微镜下可见虫体黑色的排泄囊和2个弯曲的肠支。

感染84 d犬解剖后，见心脏及肺脏周围粘膜上偶见小孔，肺脏上有明显囊肿。解剖剪剪开囊肿囊后，可见每个囊内有1～2条肺吸虫成虫，见图1。成虫体型椭圆，肉红色，口腹吸盘大小略等；压片镜检见卵巢位于腹吸盘两侧，5～6叶，睾丸4～6叶，卵巢较睾丸长而大[5]。其他3只犬于饲养16周后不同时期解剖，在肺脏中均发现并提取出成虫。

图1 卫氏并殖吸虫成虫

二、抗体变化情况

1.犬抗体反应

3只感染犬经ELISA检测，均出现抗体阳性反应。1号犬第6周抗体阳性(OD值为1.124，S/N=2.24)，第12周抗体水平达到高峰(OD值为1.827，S/N=3.64)，其后维持在S/N=3.08～3.51；2号犬第3周抗体阳性(OD值为1.847，S/N=2.57)，第5周抗体水平达到高峰(OD值为1.952，S/N=2.72)，其后维持在S/N=2.37～2.71；3号犬第3周抗体阳性(OD值为1.314，S/N=2.15)，第15周抗体水平呈现高峰(OD值为1.641，S/N=2.68)，见图2。

图2 ELISA法检测感染卫生并殖吸虫犬血清抗体动态变化

2.鼠抗体反应

3只感染鼠1周检测抗体阳性(1-3号大鼠血清抗体检测OD值分别为0.932、1.947和1.049，S/N范围为5.39～11.26)，2～3周抗体水平即达到高峰；其后抗体逐渐下降，感染后8～16周仍呈阳性，抗体水平维持较低水平，见图3。

图3 ELISA法检测感染卫氏并殖吸虫大鼠血清

讨 论

本实验发现，感染犬于第3周左右检测抗体阳性，并在第5～12周抗体水平达到高峰，截至感染后的第16周，抗体仍维持在较高水平，此研究结果与章子豪、陈韶红等[6,7]研究结果一致，与卫氏并殖吸虫囊蚴进入犬体至发育为成虫的生理时间(60～90 d)相吻合。感染大鼠后1周检测抗体阳性，2～3周抗体水平达到高峰，后抗体水平有所下降，至第8周抗体经ELISA检测维持在较低的阳性水平。大鼠感染肺吸虫囊蚴2～3周，童虫抗体被成虫可溶性抗原探针检测到，说明童虫和成虫存在共同抗原，与Yoon Kong等[8]试验结果一致；后期抗体水平下降并最终维持在一定水平，推测与童虫在机体移行过程中发生了免疫逃避[9]有关。本实验显示，以卫氏并殖吸虫成虫可溶性抗原做探针，可检测适宜和非适宜宿主体内抗体水平变化情况，为肺吸虫病的免疫学诊断提供理论依据。在试验过程中发现大鼠经囊蚴感染后1周即检测出卫氏并殖吸虫抗体，早于犬2周，可能与囊蚴感染数量、物种差异等有关所致，但还需要开展进一步研究。

安徽皖南山区为卫氏并殖吸虫的自然疫源地[10,11]，何毅勋等[12]通过对皖南两种卫氏并殖吸虫品系特征的比较，认为我国卫氏并殖吸虫存在大小两种品系。小型品系对人体寄生不适应，未能发育成熟而停留在童虫阶段，因此人是小型品系的非适宜宿主；且通过本试验研究表明，人作为非适宜宿主对于卫氏并殖吸虫的感染存在通过抗体检测达到诊断的可能。

章子豪等[6]曾以卫氏并殖吸虫成虫抗原做探针，采用IHA法检测感染大鼠的血清，结果显示成虫抗体阳性反应较弱，且出现时间较迟，与本实验结果有所差别，这可能是ELISA检测较IHA法更敏感有关。尽管抗体检测可以作为卫氏并殖吸虫感染的免疫学诊断方法，但也存在早期诊断和疗效考核等方面的不足，且成虫粗抗原与其他寄生虫存在共同抗原，因此应着手开始敏感性高、特异性强的诊断分子的筛选[13](如cDNA文库建立及诊断分子的筛选等)以及分子生物学诊断方法的建立[14](如LAMP等)。

此外，本实验还对收集自休宁的溪蟹囊蚴大小进行了比较，发现了较大的卫氏并殖吸虫囊蚴，最大尺寸大小约541 μm×564 μm，可能为三倍体型囊蚴[15,16]。大型品系肺吸虫囊蚴一旦被人体误食，极易引起咳嗽、咯血、咯痰及浸润性、囊肿和结节等较重的临床症状，故应引起科研人员以及临床医务人员的高度重视。