酸敏感离子通道1a在酸诱导的大鼠膝关节滑膜成纤维细胞自噬中的作用及其机制研究
2019-09-27陈霖王新亮
陈霖 王新亮
【摘要】 目的：探讨酸敏感离子通道1a（ASIC1a）在酸诱导的大鼠膝关节滑膜成纤维细胞（SFs）自噬中的作用和机制。方法：分离大鼠膝关节SFs，在不同胞外酸化条件处理后检测软骨自噬蛋白（LC3-Ⅱ）的表达。观察ASIC1a阻断剂对自噬小体数量、自噬基因（Beclin-1）mRNA的表达，自噬相关蛋白（RRK1/2、p38MAPK）磷酸化的影响;观察RRK1/2、p38MAPK磷酸化抑制剂对Beclin-1 mRNA、LC3-Ⅱ蛋白表达的影响。结果：HE染色结果证实符合SFs的特征;pH 7.4组LC3-Ⅱ蛋白表达
【关键词】 酸敏感离子通道1a; 膝关节炎; 滑膜成纤维细胞; 自噬; 机制
Study on the Role and Mechanism of Acid-sensitive Ion Channel 1a in Acid-induced Autophagy of Synovial Fibroblasts of Knee Joint in Rats/CHEN Lin，WANG Xinliang.//Medical Innovation of China，2019，16（20）：0-027
【Abstract】 Objective：To investigate the role of acid-sensitive ion channel 1a（ASIC1a）in acid-induced autophagy of rat knee synovial fibroblasts（SFs）and its mechanism.Method：Rat knee joints SFs were separated，the expression of cartilage autophagy protein（LC3-Ⅱ）was detected under different extracellular acidification conditions.The effects of ASIC1a blockers on the number of autophagy bodies，the expression of autophagy gene（Beclin-1）mRNA and the phosphorylation of autophagy associated protein（RRK1/2，p38MAPK）were observed;the effect of RRK1/2，p38MAPK phosphorylation inhibitor on the expression of Beclin-1 mRNA，LC3-Ⅱ protein was observed.Result：The results of HE staining showed that it was consistent with the characteristics of SFs cells.The expression of LC3-Ⅱ protein in pH 7.4 group < pH 7.0 group < pH 6.5 group < pH 6.0 group/pH 5.5 group，there was no significant difference between the pH 6.0 group and the pH 5.5 group（P>0.05），but there were significant differences between the other each two groups（P<0.05）.The organelle of pH 7.4 group was intact and regular in morphology，mitochondrial swelling was observed in the pH 6.0 group，and the number of autophagosomes encapsulated by bilayer membrane was more.The number of cytoplasmic autophagosomes in the pH 6.0 + Amiloride group was slightly less，and the organelle morphology was restored.The number of cytoplasmic autophagosomes in the pH 6.0 + PcTX1 group was higher，and the organelles were close to normal.The expression of Beclin-1 mRNA in pH 7.4 group < pH 6.0 PcTX1 group < pH 6.0 Amiloride group < pH 6.0 group，and there were significant differences between the two groups（P<0.05）.ERK1/2，p38MAPK phosphorylation levels in pH 7.4 group < pH 6.0 PcTX1 group < pH 6.0 Amiloride group < pH 6.0 group，and there were significant differences between the two groups（P<0.05）.Expressions of Beclin-1 mRNA and LC3-Ⅱ protein in pH 7.4 group < pH 6.0 + PD98059 group < pH 6.0 + PcTX1 group < pH 6.0 + SB203580 group/pH 6.0 group，and there was no significant difference in the expressions of Beclin-1 mRNA and LC3-Ⅱ protein between the pH 6.0 + SB203580 group and the pH 6.0 group（P>0.05），but there were significant differences between the other each two groups（P<0.05）.Conclusion：Extracellular acidification conditions can induce autophagy of SFs in rat knee synovium，blocking ASIC1a can significantly weaken this effect，and the effect of specific blockers is better，the mechanism may be related to regulating Beclin-1 gene expression and inhibiting ERK1/2 phosphorylation.
【Key words】 Acid-sensitive ion channel 1a; Knee arthritis; Synovial fibroblasts; Autophagy; Mechanisms
First-authors address：Guangzhou First Peoples Hospital，Guangzhou 510180，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.20.006
类风湿关节炎是临床常见的自身免疫性疾病，呈全身性发展，以慢性多关节炎症为主要临床表现[1]。膝关节滑膜成纤维细胞（SFs）自噬是软骨破坏的基础病因，而骨质破坏则是致残的重要原因，因此探讨膝关节SFs自噬的机制意义重大[2-3]。酸敏感离子通道1a（ASIC1a）属于上皮Na+通道/退化蛋白超家族成员，有研究证实其在大鼠膝关节炎关节软骨破坏中有积极作用[4]。在类风湿关节炎患者中，膝关节软骨常呈进行性加重性受损，推测可以通过抑制膝关节SFs自噬抑制软骨破坏。在类风湿关节炎患者中，膝关节软骨常呈进行性加重性受损，推测可以通过抑制膝关节SFs自噬抑制软骨破坏。因此本研究特设计离体实验，首先探讨合适的胞外酸化条件，然后重点分析ASIC1a在酸诱导的大鼠膝关节SFs自噬中的作用及机制，以期为类风湿关节炎新药的研发提供思路和方向。现将研究结果报道如下。
1 对象与方法
1.1 對象 成年雄性SD大鼠20只，SPF级，7周龄，体质量180～200 g，购自河南省实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK（豫）20160001。
1.2 方法
1.2.1 大鼠膝关节SFs分离、培养与鉴定 Ⅱ型胶原酶消化法分离大鼠膝关节，常规进行细胞培养，对第3代细胞进行HE染色鉴定。
1.2.2 不同胞外酸化条件细胞自噬蛋白（LC3-Ⅱ）的表达检测 设置pH 7.4组、pH 7.0组、pH 6.5组、pH 6.0组、pH 5.5组（每组5个样本），培养30 min后分别加入pH为6.0的培养基共培养3 h。以Western blot检测LC3-Ⅱ表达。
1.2.3 不同干预方法自噬小体数量变化检测 设置pH 7.4组、pH 6.0组、pH 6.0+Amiloride组、pH 6.0+PcTX1组（每组5个样本），其中Amiloride浓度为100 μmol/L，PcTX1浓度为100 μg/L，于给药
30 min后加入pH为6.0的培养基共培养3 h。常规接种、培养、消化并离心分离。固定后以梯度丙酮脱水，包埋，聚合。切片后染色并以透射电镜观察。
1.2.4 不同干预方法自噬基因（Beclin-1）mRNA的表达检测 组别设置、干预和操作方法均参照1.2.3。采用聚合酶链反应（PCR）法检测Beclin-1 mRNA，提取总核糖核酸（RNA），测定其含量、纯度和完整性后进行扩增反应，反应条件：94 ℃（5 min）→94 ℃（40 s）→51 ℃（40 s）→72 ℃（1 min），35个循环，72 ℃（10 min）。电泳后以凝胶成像系统分析。
1.2.5 不同干预方法自噬相关蛋白（ERK1/2、p38MAPK）磷酸化水平检测 组别设置、干预方法均参照1.2.3。以Western blot检测ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平，操作方法参照1.2.2。
1.2.6 不同干预方法Beclin-1 mRNA、LC3-Ⅱ蛋白表达检测 设置pH 7.4组、pH 6.0组、pH 6.0+PcTX1组、pH 6.0+PD98059组、pH 6.0+SB203580组（每组5个样本），干预30 min后加入pH为6.0的培养基共培养3 h，参照1.2.4检测Beclin-1 mRNA表达，参照1.2.2检测LC3-Ⅱ蛋白表达。
1.3 统计学处理 采用SPSS 25.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，多样本比较采用单因素方差分析，以SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SFs鉴定结果 HE染色结果显示细胞多呈长梭形，核大且呈椭圆形，靠近胞质的中央，细胞呈漩涡样或平行样排列，集落性生长，符合SFs细胞的特征，见图1。
2.2 不同胞外酸化条件下LC3-Ⅱ蛋白表达对
比 pH 7.4组、pH 7.0组、pH 6.5组、pH 6.0组、pH 5.5组的LC3-Ⅱ蛋白表达分别为（0.15±0.03）、（0.26±0.06）、（0.59±0.12）、（0.98±0.15）、（0.96±0.13），差异有统计学意义（F=67.538，P=0.000），且pH 7.4组LC3-Ⅱ蛋白表达
2.3 不同干预措施组间自噬小体数量对比 透射电镜观察结果显示，pH 7.4组细胞器完整且形态规则（图3a），pH 6.0组可见线粒体肿胀，且双层膜包裹的细胞自噬小体较多（图3b），pH 6.0+Amiloride组细胞质自噬小体数量稍少，细胞器形态有所恢复（图3c），pH 6.0+PcTX1组细胞质自噬小体数量更高，细胞器接近正常（图3d）。
2.4 不同干预措施组间Beclin-1 mRNA表达对比 pH 7.4组、pH 6.0组、pH 6.0+Amiloride组、
pH 6.0+PcTX1组Beclin-1 mRNA表达分别为（0.75±0.13）、（1.25±0.18）、（0.99±0.15）、（0.85±0.11），各组Beclin-1 mRNA表达对比差异有统计学意义（F=11.220，P=0.000），其中pH 7.4组 2.5 不同干预措施组间ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平对比 各组ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平对比，差异均有统计学意义（P<0.05），其中pH 7.4组 2.6 不同干预措施组间Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表达对比 各组Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表达对比，差异均有统计学意义（P<0.05），pH 7.4组 3 讨论 本研究HE染色结果显示所取细胞经分离和培养，生长为特征明显的SFs，多呈长梭形，表现为集落性生长，为后续实验的顺利进行奠定了基础。在不同胞外酸化条件干预后，各组LC3-Ⅱ蛋白表达呈明显异常，pH 5.5～7.0组中其表达水平均明显高于pH 7.4组，可知胞外酸化处理可增强LC3-Ⅱ蛋白表达。LC3-Ⅱ蛋白为细胞自噬的标志性蛋白，在细胞自噬过程中存在相关的翻译后修饰，在自噬发生过程中该蛋白可在合成后随即被Atg4剪切掉羧基端，并经相关生物学过程的加工和处理，参与推进细胞自噬进程[5-6]。由此可知pH 5.5～7.0胞外酸化条件均可促进SFs细胞自噬，而pH 6.0组和pH 5.5组中LC3-Ⅱ蛋白表达均明显高于其余各组，可知其对SFs细胞自噬的促进作用更强，故本研究后续实验选择pH 6.0组作为酸化处理组。 此外，在不同干预措施处理后，pH 7.4组未见自噬小体，pH 6.0组自噬小体明显可见，加入ASIC1a阻断剂处理的两组细胞器状态明显优于pH 6.0组，且自噬小体明显少于pH 6.0组，而加入PcTX1组的透射电镜下观察的结果与pH 7.4组最为接近，可知给予ASIC1a阻断剂干预可减轻胞外酸化所致的大鼠膝关节SFs自噬情况，且PcTX1的作用明显优于Amiloride。ASIC1a属于钙渗透性酸敏感离子通道，胞外酸化可介导其开放通道，进而促进钙离子内流，导致细胞内外钙离子失衡，从而可引发一系列生物学效应，包括细胞自噬，因而胞外酸化可促进细胞自噬，而经过ASIC1a阻断剂干预后，即使在酸化条件下，钙离子通道的开放仍受抑制，钙离子内流受阻，因此细胞自噬可得到控制，且ASIC1a特异性阻断剂的作用更佳[7-9]。另外，不同干预措施Beclin-1 mRNA表达、ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平对比结果可知，pH 7.4组 在本研究进一步的对比结果中显示，不同干预措施组间Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表达有明显差异，其中pH 7.4组最低，pH 6.0组最高，证实胞外酸化环境可上调Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表达，促进大鼠膝关节SFs自噬;而pH 6.0+PD98059组中Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表达明显低于除pH 7.4外的其余三组，pH 6.0+SB203580组中Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表达则与pH 6.0组相近，表明在胞外酸化条件下加入p38MAPK磷酸化阻断剂并不会显著影响Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表达，而加入ERK1/2磷酸化阻断剂则可显著抑制Beclin-1 mRNA和LC3-Ⅱ蛋白表达，意味着胞外酸化环境所致的大鼠膝关节SFs自噬可得到显著控制，推测抑制ERK1/2磷酸化水平可减轻胞外酸化所致的SFs自噬，而在胞外酸化干预大鼠膝关节SFs自噬的过程中加入ASIC1a阻断剂很可能是通过抑制ERK1/2磷酸化实现弱化细胞自噬的作用的。 综上所述，胞外酸化條件可诱导大鼠膝关节SFs自噬，给予ASIC1a非特异性和特异性阻断剂均能够弱化此作用，且ASIC1a特异性阻断剂PcTX1的作用更强，Beclin-1基因表达可显著下调，ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平也可得到显著控制;在胞外酸化条件下加入ERK1/2磷酸化阻断剂可有效抑制细胞自噬，因此推测上述作用是通过抑制Beclin-1基因表达，控制ERK1/2磷酸化水平实现的。本研究提示ASIC1a特异性阻断剂PcTX1、ERK1/2磷酸化阻断剂均可抑制胞外酸化所致的膝关节SFs自噬，为类风湿性关节炎患者新药的研发指明了方向，而其在人类中应用的可行性、有效性和安全性均需更深入观察探讨，应作为未来的研究方向。 参考文献 [1] Bitar M S.The GSK-3β/Fyn/Nrf2 pathway in fibroblasts and wounds of type 2 diabetes：on the road to an evidence-based therapy of non-healing wounds[J].Adipocyte，2012，1（3）：161-163. [2] Jin Y，Choi A M.Cross talk between autophagy and apoptosis in pulmonary hypertension[J].Pulm Circ，2012，2（4）：407-414. [3] Efeyan A，Zoncu R，Chang S，et al.Regulation of mTORC1 by the Rag GTPases is necessary for neonatal autophagy and survival[J].Nature，2013，493（7434）：679-683. [4]江晟，陈飞虎，陈寸知，等.siRNA沉默ASIC1a基因对佐剂性关节炎大鼠关节软骨细胞凋亡的影响研究[J].中国临床药理学与治疗学，2012，17（3）：256-262. [5] Itakura E，Kishi-Itakura C，Mizushima N.The hairpin-type tail-anchored SNARE syntaxin 17 targets to autophagosomes for fusion with endosomes/lysosomes[J].Cell，2012，151（6）：1256-1269. [6] Qiang L，Wu C，Ming M，et al.Autophagy controls p38 activation to promote cell survival under genotoxic stress[J].J Biol Chem，2013，288（3）：1603-1611. [7] Li L，Guan K L.Microtubule-associated protein/microtubule affinity-regulating kinase 4（MARK4）is a negative regulator of the mammalian target of rapamycin complex 1（mTORC1）[J]. J Biol Chem，2013，288（1）：703-708. [8]王凡，卢锦华，何杰，等.MiR-147a通过抑制细胞自噬促进HIF-1α蛋白的积累[J].现代生物医学进展，2017，17（2）：10-13，50. [9]程佑，王超鹏，周美娟，等.UVB诱导A375细胞自噬与凋亡调控机制探讨[J].中国职业医学，2018，45（2）：31-37. [10] Bess A S，Ryde I T，Hinton D E，et al.UVC-induced mitochondrial degradation via autophagy correlates with mtDNA damage removal in primary human fibroblasts[J].J Biochem Mol Toxicol，2013，27（1）：28-41. [11]杨其彬，何泳龙，青玉凤，等.自噬相关基因Beclin-1在间歇期痛风性关节炎患者外周血单个核细胞中的表达变化及意义[J].山东医药，2018，58（37）：31-34. [12]徐非.Beclin 1蛋白通过核定位以一种不依赖于自噬的方式参与辐照引起的DNA损伤修复[D].苏州：苏州大学，2017. [13]吕梦，陆航.Beclin1基因在SW620细胞自噬和凋亡中作用[J].南方医科大学学报，2017，37（3）：97-101. [14]汪立梅，张家明，吕正涛，等.机械应力调控软骨细胞炎症反应中长链非编码RNA的机制研究[J].中华物理医学与康复杂志，2017，39（2）：86-91. [15]張礼菊，胡伟，唐杰，等.ASIC1a对大鼠关节软骨细胞基质代谢及MAPK信号通路表达的影响[J].中国药理学通报，2014，30（8）：1165-1170. [16] Tatti M，Motta M，Di Bartolomeo S，et al.Cathepsin-mediated regulation of autophagy in saposin C deficiency[J].Autophagy，2013，9（2）：241-243.
