多根硬皮马勃液体发酵工艺优化及抑菌活性研究

史伟国，白国栋，宗希明，袁 寰，佟德成，高庆东

(1.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯市中医医院，黑龙江佳木斯 154002)

多根硬皮马勃[SclerodermaPolyrhizum(J.F.Gmel.)Pers.]，为担子菌亚门，硬皮马勃目，硬皮马勃科，硬皮马勃属的大型真菌，具有消肿、止血等药用功效[1-2]。它是药食两用真菌的典型代表[3-6]。其作为药用时可以单独入药，水煎液用于治疗老年外阴湿疹[7]及痔疮手术后的排便困难[8]、其发酵物对慢性肺损伤具有治疗作用[9]。与其他药物处方连用，可治疗慢性咳嗽、咽痛、亚急性甲状腺炎、缓解鼻咽癌放化疗副反应、治疗压疮等疾病[10-15]。

目前对多根硬皮马勃的研究主要是关于其化学成分及结构分析方面，对其液体发酵工艺及抑菌活性研究鲜有报道。本研究采取星点设计-响应面法(Central composite design-response surface methodology，CCD-RSM)对其液体发酵工艺进行优化，在摇床转速一定的情况下研究发酵温度、发酵时间和接种量对多根硬皮马勃胞外粗多糖(Polysaccharides fromSclerodermaPolyrhizum，PSP)含量的影响，同时对不同浓度的PSP溶液体外抑菌效果进行考察，以期能为多根硬皮马勃的进一步研究提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多根硬皮马勃，中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所；大肠埃希菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，由佳木斯市中医医院化验室提供。葡萄糖、硫酸镁、苯酚、硫酸、氯化钠、氢氧化钠，天津市凯通化学试剂有限公司；磷酸二氢钾，上海浩洋生物科技技术有限公司；琼脂、牛肉膏、蛋白胨北京奥博生物技术有限责任公司；土豆购于当地农贸市场。

马勃真菌斜面培养基(1 L)：取马铃薯：200 g，葡萄糖：20 g，琼脂：20 g，pH自然，高压蒸汽灭菌(121℃，30 min)，待用；液体种子培养基(1 L)：取马铃薯：200 g，葡萄糖：30 g，蛋白胨：30 g，KH2PO4：1 g，MgSO4：1 g，pH自然，高压蒸汽灭菌(121℃，30 min)，待用；液体发酵培养基(1 L)：取葡萄糖：28 g，蛋白胨：18 g，KH2PO4：1 g，MgSO4：1 g，pH自然，高压蒸汽灭菌(121℃，30 min)，待用；细菌斜面培养基(1 L)：取牛肉膏：3 g，蛋白胨：10 g，NaCl：5 g，琼脂：20 g，pH 7.0～7.2，高压蒸汽灭菌(121℃，30 min)，待用；细菌液体培养基(1 L)：取牛肉膏：3 g，蛋白胨：10 g，NaCl：5 g，pH 7.0～7.2，高压蒸汽灭菌(121℃，30 min)，待用；平板培养基(1L)：取牛肉膏：3 g，蛋白胨：10 g，NaCl：5 g，琼脂：20 g，pH 7.0～7.2，高压蒸汽灭菌(121℃，30 min)，待用。

1.2 仪器与设备

AUW220D型电子分析天平(岛津公司)；XY-X3恒温摇瓶机(山东大学制造)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；YM50立式高压灭菌锅(上海三申有限公司)；DN-360型电热恒温培养箱(北京科伟永兴仪器有限公司)；ZHJH-C1214B垂直流超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；PHS-3DW型pH计(安徽合肥卓尔仪器仪表有限公司)；UV-2550型紫外可见分光光度计(岛津公司)；Vir Tis wizard 2.0型真空冷冻干燥机(美国SP INDUSTRIES INC公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 液体种子的制备

将4℃保存的多根硬皮马勃菌种用斜面培养基27℃，48 h活化，再将活化后的菌种切成大小相同的5 mm×5 mm见方的菌块，移至灭菌后的研钵中，加10 mL无菌水研磨均匀，转入到灭菌后的液体种子培养基内，27℃，摇床转速150 rpm/min，培养72 h备用。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的制备

精密称取干燥至恒重葡萄糖粉末10 mg，定容至100 ml，待葡萄糖完全溶解,得0.1 mg/ml的葡萄糖标准溶液。精密称取葡萄糖标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml分别置于试管中，分别加水2、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 ml，加5%苯酚溶液1.0 ml，震匀，快速加入浓硫酸5.0 ml，放置10 min，震匀，置100℃水浴15 min后，取出室温放凉，测定吸光度，在490 nm波长处出现最高值，以葡萄糖的浓度(C)为横坐标，吸光度(A490)为纵坐标绘制曲线。

1.3.3 胞外粗多糖含量的测定

精密吸取发酵液稀释至合适浓度的样品溶液2 mL，按照苯酚-硫酸法测定样品溶液吸光度。根据样品吸光度计算发酵液中多根硬皮马勃胞外粗多糖含量。

1.3.4 发酵条件单因素试验设计

在摇床转速固定为150 rpm/min的条件下，在发酵温度分别是25、26、27、28、29℃，发酵时间分别为24、48、72、96、120 h，接种量分别为3、6、10、15、20%的条件下将液体种子接入发酵培养基中，考察发酵温度、发酵时间和接种量对发酵液中PSP含量的影响。

1.3.5 星点设计-响应面试验设计

运用Design-Expert 8.0.6软件进行3因素5水平CCD-RSM实验设计，通过对单因素试验结果的分析，以发酵温度(X1)、发酵时间(X2)和接种量(X3)3个因素分别选取5个水平对PSP含量(Y)进行考察。试验因素水平编码见表1。

表1 液体发酵条件分析因素与水平Table 1 Factors and levels in response surface design of PSP liquidfermentation condition

1.3.6 多根硬皮马勃胞外粗多糖的抑菌性考察

将浸泡于浓度为：0.1 mg/mL、0.01 mg/mL、0.001 mg/mL的PSP溶液中的滤纸片水分完全挥干，按“品”字形分贴于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的平板培养基上，每个培养基贴3片，以无菌水做阴性对照组，三氯新做阳性对照。37℃培养24 h。通过测量抑菌圈的直径，来考察PSP的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线线性考察结果

根据葡萄糖对照品浓度(C)与吸光度值(A)的线性关系，得回归方程A=50.96C+0.0153，R2=0.9991，说明该方程线性关系良好。

即马勃胞外粗多糖含量(mg/mL)=[(A-0.0153)/50.96×稀释倍数×样品溶液体积]/1000

式中：A为马勃样品的吸光度。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 发酵温度对马勃胞外粗多糖含量的影响

如图1所示，PSP的含量随着温度的升高而增大，当温度超过27℃，含量小幅度下降，说明多根硬皮马勃对温度的变化比较敏感，随着温度的提升，马勃真菌的活力增加，此时如果继续增加温度，会一定程度上抑制真菌活力，使其代谢能力降低。因此选择27℃为CCD-RSM试验发酵温度的中心点。

图1 发酵温度对马勃胞外粗多糖含量的影响Fig.1 Influence of fermentation temperature on PSP yield

2.2.2 发酵时间对马勃胞外粗多糖含量的影响

如图2所示，PSP含量的随着时间的延长是呈上升趋势，当发酵时间超过72 h，多糖含量变化不明显。说明马勃菌种的生物活力随着时间的延长而逐渐曾强。随着发酵的继续，菌丝细胞进入稳定期，生物活力逐渐降低，对发酵液中的多糖含量变化影响不大。如果继续发酵，部分菌丝体可能会有自溶现象的发生，给发酵液中引入更多的其他成分，会对后续试验的结果产生影响，因此选择72 h为CCD-RSM试验发酵时间的中心点。

图2 发酵时间对马勃胞外粗多糖含量的影响Fig.2 Influence of fermentation time on PSP yield

2.2.3 接种量对马勃胞粗外多糖含的影响

如图3所示，PSP的含量随着接种量的增加而增多，后多糖含量变化不明显。说明发酵液中的营养成分数量一样，如果接种量过多，营养成分数量有限，养分消耗过大，马勃真菌的活性降低，可能会抑制制多糖的合成，而且接种量过大，也会提高成本，造成菌种资源的浪费，因此选择接种量10%为CCD-RSM试验接种量的中心点。

图3 接种量对马勃胞外粗多糖含量的影响Fig.3 Influence of fermentation inoculum on PSP yield

2.3 星点设计-响应面试验结果与分析

2.3.1 CCD-RSM模型建立及结果

通过响应面设计对PSP含量建立数学模型，优化发酵工艺参数，以发酵温度、发酵时间、接种量为自变量，PSP含量为响应值。试验结果见表2。

2.3.2 响应面回归模型的建立及显著项检验

将表2中PSP含量进行回归分析，得到马勃发酵液中PSP含量回归方程为：Y=11.50-0.28X1-0.55X2-0.16X3+0.58X1X2-077X1X3-0.17X2X3-0.78X2X1-0.64X2X2-0.70X2X3(R2=0.9311)。

模型的F值为15.02，P<0.05，表明该试验的回、归模型较显著；失拟误差P>0.05，不显著，表明该模型稳定性较好，该模型=能较好的模拟PSP真实含量与各变量之间的关系。根据回归模型方差分析可知：X1(F=5.39，P=0.0427);X2(F=20.65，P=0.0011)；X1X2(F=12.91，P=0.0049)；X2X1(F=46.93，P<0.0001)；X2X2(F=31.52，P=0.0002)；X2X3(F=37.67，P=0.0001)；可见，X2X1为极显著项；X1、X2、X1X2、X2X2、X2X3为显著项。

表2 响应面设计模型及试验值Table 2 CCD-RSM design matrix and the experimental values

2.3.3 工艺参数的优化与验证

使用Design-Expert 8.0.6软件，对已得二项式拟合方程绘制3D响应面与等高线，见图4-6。各要素对响应值大小的影响，体现在应曲面的起伏高度，即曲面起伏高度越陡，等高线越密集，表示该因素对响应值影响越明显，其关系成正比。两因素交互作用大，则等高线表示成椭圆形，反之，表示成圆形。根据3D响应面与等高线图分析，影响发酵液中马勃胞外粗多糖含量的培养条件显著性顺序为：发酵时间>发酵温度>接种量.

通过各因素的优化，得到马勃液体发酵培养基最佳培养条件条件：发酵温度26.6℃，发酵时间64.71 h、接种量9.98%，发酵液中马勃胞外粗多糖的含量为11.73 mg/mL。按照上述条件，结合实验室实际情况，采用发酵温度 27℃、发酵时间65 h、接种量10%，重复试验3次，粗多糖的平均含量为11.56 mg/mL，验证的结果与模型预测值较吻合。因此，该方法可以考虑作为马勃液体发酵培养基最佳培养条件的优化与预测。

2.4 抑菌考察结果分析

本实验采用滤纸片法研究PSP对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌效果。由表3可知，PSP对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌均有抑制作用。在高浓度时，对金黄色葡萄球菌的抑制能力最强，大肠埃希菌的抑制能力较弱，其抑制能力会随着浓度的降低而减弱；对于铜绿假单胞菌，PSP溶液没有抑制作用。通过对比可知，PSP对革兰氏阳性菌的抑菌能力优于对革兰氏阴性菌，综合分析PSP对三种常见致病菌的抑制能力为：金黄色葡萄球菌>大肠埃希菌>铜绿假单胞菌。

图4 发酵温度与发酵时间对PSP含量影响的响应面和等高线Fig.4 Response Surface and contour plots of temperature and time on the content of PSP

图5 发酵温度与接种量对PSP含量影响的响应面和等高线Fig.5 Response Surface and contour plots of temperature and inoculum on the content of PSP

图6 发酵时间与接种量对PSP含量影响的响应面和等高线Fig.6 Response Surface and contour plots of time and inoculum on the content of PSP

表3 马勃粗多糖的抑菌效果Table 3 Antibacterial effect of PSP

注：抑菌圈直径单位：mm，抑菌圈直径含滤纸片直径6 mm，“-”表示无抑菌圈。

3 讨论与结论

本次试验是在pH自然、摇床转速固定的条件下考察多根硬皮马勃液体发酵的培养条件，研究是建立在单因素实验的结果上，通过CCD-RSM建立模型，并对回归方程、响应面图与等高线图的分析可知：影响发酵液中马勃胞外粗多糖含量的培养条件显著性顺序为：发酵时间>发酵温度>接种量。获得多根硬皮马勃粗多糖液体发酵最佳培养条件：发酵温度26.6℃，发酵时间64.71 h、接种量9.98%，发酵液中PSP的含量为11.73 mg/mL。按照上述条件，结合实验室实际情况，采用发酵温度 27℃、发酵时间65 h、接种量10%，经过3次验证，PSP平均含量为11.56 mg/mL。同时采用滤纸片法考察PSP对三种常见致病菌的抑菌效果。抑制能力表现为：金黄色葡萄球菌>大肠埃希菌>铜绿假单胞菌。本结果可为多根硬皮马勃胞外粗多糖的规模化生产提供一定的技术支持和参考依据，为促进马勃粗多糖的进一步的开发和利用奠定基础。

本次试验在此基础上得出了最佳的培养条件，但有关不同的pH值以及摇床转速对马勃胞外粗多糖含量的影响还需进一步深入研究。