COX-2抑制剂对慢性前列腺炎大鼠射精时间的影响

郑 涛，王 瑞，张天标，吕坤龙，贾东辉，杨 帆，张卫星

郑州大学第一附属医院泌尿外科郑州450052

慢性前列腺炎(chronic prostatitis，CP)和早泄(premature ejaculation，PE)均为泌尿外科和男科常见病。CP通常表现为尿频、尿急、尿痛和夜尿增多等排尿症状的改变以及骨盆区域疼痛，在成年男性中发病率约为8．4%［1］。PE定义为总是或几乎总是发生在插入阴道以前或插入阴道的1 min以内射精，完全或几乎完全缺乏控制射精的能力，并造成苦恼、忧虑、挫折和(或)回避性亲热等不良后果。PE影响20%～30%成年男性，可分为原发性PE和继发性PE［2］。CP是最易导致继发性 PE 的疾病［3］。虽然CP导致PE的机制尚不清楚，但多认为与前列腺部尿道炎症以及疼痛有关。COX-2抑制剂具有较强的抗炎镇痛作用，能有效缓解CP患者的症状，降低 NIH-CPSI评分［4-5］。5-羟色胺(5-hydroxytryptamin，5-HT)是一种重要的中枢神经递质，对炎症、疼痛和性行为都有调控作用。本研究应用自身免疫方法建立CP大鼠模型，观察了COX-2抑制剂对CP大鼠射精时间的影响，并通过检测5-HT及其受体水平的变化，对CP合并PE的机制作了初步探讨。

1 材料与方法

1．1 实验动物和主要试剂 SPF级Wistar大鼠90只(体重250～300 g，3～4个月龄)，其中雄性54只，雌性36只，购自河南省实验动物中心。苯甲酸雌二醇注射液和黄体酮注射液购自天津金耀氨基酸有限公司;完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和Triton X-100购自美国Sigma公司;BCA蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;COX-2抑制剂塞来昔布胶囊由辉瑞制药有限公司提供;5-HT抗体(ab10385)购自美国Abcam公司;5-HT1A抗体(sc-10801)、5-HT2C 抗体(sc-10802)、5-HT 转运体(5-HTT)抗体(sc-13997)购自美国Santa Cruz公司;山羊抗兔鼠通用二抗(HRP)、免疫组化试剂盒和DAB显色剂购自丹麦 Dako公司;IL-1β和 TNF-α ELISA试剂盒购自美国R＆D Systems公司。

1．2 雄性大鼠分组 雌鼠切除双侧卵巢2周后，分别在交配实验前48 h和4 h皮下注射苯甲酸雌二醇20μg和黄体酮500μg(分别用0．1 mL的橄榄油溶解)来诱导雌鼠发情。造模前1周，每天19:00～21:00进行交配实验，用昏暗的红灯照明，调至可以看清和录像为止，把雄鼠和发情状态良好的雌鼠1∶1合笼，将连续5次筛选实验均表现出性行为的雄鼠视为性功能正常。将筛选出的具有正常性功能的雄鼠随机分为3组:模型组12只，COX-2抑制剂组10只，正常对照组10只。

1．3 CP大鼠模型的制备和给药 ①制备大鼠前列腺蛋白提取液:取性功能异常的雄性Wistar大鼠18只，脱脊处死，在无菌条件下剥取前列腺组织，称重后用冷生理盐水洗净，加入等体积Triton X-100生理盐水溶液，在冰水浴上用玻璃匀浆器制成匀浆，4℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清液，采用BCA方法测定蛋白质浓度，再用0．01 mol/L pH 7．4 PBS将该蛋白提纯液浓度调至60 g/L备用。②制备CP模型:第0天，模型组和COX-2抑制剂组腹侧皮下多点注射大鼠前列腺蛋白提纯液和弗氏完全佐剂(用注射器互推法制成比例1∶1)混悬液1 mL。第21天，多点皮下注射大鼠前列腺蛋白提纯液和不完全弗氏佐剂(体积比1∶1)混悬液1 mL，以加强免疫。正常对照组于相同时间行皮下多点注射生理盐水1 mL。③第2次注射蛋白提纯液4周后，将大鼠戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉起效后，取下腹部正中切口，显露前列腺，仔细观察后关闭切口。12只模型组大鼠和10只COX-2抑制剂组大鼠前列腺充血水肿，提示造模成功。造模成功后开始灌胃给药，COX-2抑制剂组给予塞来昔布(用生理盐水制成1．8 g/L混悬液)18 mg/(kg·d);模型组和正常对照组给予生理盐水0．1 mL/(kg·d)，随体重增加调整灌胃量。共给药4周。

1．4 交配实验 给药4周后行交配实验，观察并记录大鼠在30 min内的交配行为。骑跨潜伏期(mount latency，ML):即从测试开始到雄鼠第1次骑跨雌鼠的时间，有无插入均计数;插入潜伏期(intromission latency，IL):从测试开始到雄鼠有第1次插入的时间;射精潜伏期(ejaculation latency，EL):从雄鼠第1次插入到射精的时间。

1．5 取材 交配实验后，将大鼠戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，沿胸骨旁线迅速剪开大鼠胸腹腔，穿刺腹腔静脉，采血3～5 mL，在4℃冰箱放置2 h后2 000 r/min离心15 min，取上清液置于－70℃冰箱保存备用。显露心脏，将带有输液皮条的粗针头自心尖向上进针至主动脉起始端，用血管钳固定针头，剪开右心耳排液，快速灌注0．1 mol/L PBS。至肝脏变白，自右心耳流出的液体清亮停止灌注。模型组取6只大鼠，正常对照组和COX-2抑制剂组各取5只大鼠，用小止血钳从背部头端的椎骨开始仔细咬开棘突和椎板，完整取出脊髓，在冰上切取T13～L2和L5～S2段脊髓分别放入EP管，置于液氮保存。剩余的大鼠接着灌注40 g/L多聚甲醛约300 mL，先快后慢，至大鼠四肢强直僵硬后停止灌注。用上述方法取出T13～L2和L5～S2段脊髓后固定。

1．6 HE染色 上述取材后的大鼠，摘取前列腺组织，生理盐水洗净，放入多聚甲醛固定，4℃过夜，石蜡包埋切片，片厚4μm，HE染色后光镜下观察。

1．7 ELISA法检测大鼠血清细胞因子TNF-α、IL-1β的表达 严格按试剂盒说明书操作进行检测。

1．8 脊髓5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT的检测 ①液氮保存的脊髓标本采用Western blot检测，利用凝胶分析软件Image-Plus行蛋白条带的灰度测定，用目的蛋白条带的灰度值除以内参β-actin的灰度值计算出目的蛋白相对表达量。②多聚甲醛溶液固定的脊髓标本采用免疫组织化学染色方法检测，每张切片随机挑选3个200倍视野进行拍照。以棕黄色为染色阳性。应用Image-Pro Plus 6．0软件分析每张照片阳性的累积光密度(IOD)值。

1．9 统计学处理 采用SPSS 19．0进行分析。各组大鼠交配实验结果，血清TNF-α和IL-8以及脊髓组织中 5-HT、5-HT1A、5-HT2C、5-HTT表达的比较采用单因素方差分析和SNK-q，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 前列腺组织形态学观察结果 模型组前列腺腺腔形态不规则，腺腔分泌物不均匀，腺上皮出现节段性坏死，间质见大量炎性细胞浸润。正常对照组未发现前列腺炎症。COX-2抑制剂组发现间质少量炎症细胞浸润(图1)。

2．2 各组大鼠交配实验结果 COX-2抑制剂组较模型组ML、IL缩短，EL延长，见表1。

2．3 各组大鼠血清 TNF-α、IL-1β结果 见表2。模型组IL-1β和TNF-α水平显著高于正常对照组(P ＜0．05)。

2．4 T13～L2和 L5～S2脊髓组织 5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT蛋白的表达 结果见图2、3和表3～6。

图1 各组大鼠前列腺组织形态学表现(HE，×200)

表1 各组大鼠M L、IL和EL的比较 s

表2 各组大鼠血清TNF-α和IL-1β水平的比较 ng/L

图2 大鼠T13～L2脊髓组织中5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT的表达

图3 各组大鼠L5～S2脊髓组织中5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT的表达

表3 各组大鼠T13～L2脊髓组织中5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT表达的比较

表4 各组大鼠L5～S2脊髓组织中5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT的表达

表5 各组大鼠T13～L2脊髓5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT阳性区域累计IOD比较

表6 各组大鼠L5～S2脊髓5-HT、5-HT1A、5-HT2C及5-HTT阳性区域累计IOD

3 讨论

CP和PE关系密切，是最易导致继发性PE的疾病［3，6］。多数学者认为PE与前列腺部尿道炎症以及疼痛有关。COX-2是催化花生四烯酸转变为前列腺素和其他前列腺素物质的限速酶，参与疼痛、肿胀、发热等炎症反应，特异性COX-2抑制剂可选择性抑制COX-2的致炎及致痛作用。临床研究［4-5］证实，COX-2抑制剂能缓解 CP症状，降低 NIH-CPSI评分。本研究结果显示，模型组大鼠前列腺上皮出现节段性坏死，间质见大量炎性细胞浸润，呈现典型的前列腺炎表现，而COX-2抑制剂组大鼠前列腺仅间质见少量内淋巴细胞浸润，炎症轻微。交配实验结果显示COX-2抑制剂组EL较模型组明显延长，与正常组无明显差异，提示COX-2抑制剂可有效控制前列腺炎症，且显著延长CP大鼠射精时间。

5-HT是一种重要的中枢神经递质，参与调节伤害感受、情感、认知、应激反应、性行为等多种认知和行为功能，其必须与相应的受体结合才能发挥生物学效应［7］。5-HT对炎症、疼痛和性行为都有调控作用。5-HT在射精过程中起着调控作用，目前发现有三种受体亚型参与了射精调控:5-HT1A、5-HT1B和5-HT2C受体。激活5-HT1A受体降低射精阈值，使射精潜伏期缩短，加速射精;与之相反，激活5-HT1B和5-HT2C受体可提高射精阈值，使射精潜伏期延长，延缓射精［7］。另外，5-HT释放入突触间隙后，可通过突触前膜上的5-HTT重新被摄取，从而降低射精阈值，加速射精。选择性5-HT再摄取抑制剂就是通过降低突触前膜5-HTT活性达到治疗PE的效果［8］。

细胞因子能够通过p38 Mapk途径上调5-HTT的表达和活性，促进5-HT的再摄取，从而降低5-HT水平［9］。Zhang等［10］发现，5-HT1AmRNA广泛分布于腰部脊髓灰质背角，应用角叉菜胶引发外周炎症性疼痛后，同侧脊髓灰质背角5-HT1A受体mRNA表达升高，8 h后达峰值。Wang等［11］应用蜂毒引发外周炎性疼痛后的1 h和4 h，同侧腰部脊髓灰质背角5-HT1A mRNA表达均升高，应用反义寡核苷酸技术敲除大鼠5-HT1A基因，其自发痛和热痛敏程度均明显减轻。研究［1］证实CP可导致机体细胞因子等炎症指标升高，而且CP的主要症状是骨盆区疼痛，CP也可以引起脊髓5-HT及其受体水平的变化。张述蓉等［12］用免疫组化及RT-PCR法检测CP大鼠脊髓5-HT及各受体的表达，发现5-HT在CP大鼠脊髓T13～L2、L3～L4和L5～S1 3个节段表达均下降。本研究结果显示，与正常对照组相比，模型组血清IL-1β和TNF-α水平升高，T13～L2及L5～S2脊髓5-HT水平下降、5-HT1A水平升高，L5～S2脊髓5-HTT升高，与预期结果相符。

已经证实前列腺的脊髓控制中枢位于T13～L2和L5～S2［13］，和位于T12～L1的泌精中枢和位于S2～S4的射精中枢［7］有部分重合。作者推测CP导致的脊髓5-HT及其受体水平的变化是CP并发PE的根本原因。本研究交配实验结果显示，模型组EL较正常对照组显著缩短;而COX-2抑制剂组前列腺炎症轻微，细胞因子水平、脊髓5-HT及其受体水平、EL同正常对照组差异无统计学意义，提示COX-2抑制剂可以减轻前列腺炎对脊髓5-HT递质系统的影响，从而延长大鼠射精时间。

综上所述，CP大鼠EL缩短，与前列腺炎症所致的脊髓5-HT水平下降、5-HT1A及5-HTT水平升高有关。COX-2抑制剂可以减轻前列腺炎对脊髓5-HT递质系统的影响，从而延长大鼠射精潜伏期，提示COX-2抑制剂可以用于治疗CP所致的继发性PE。