高危型HPV阳性患者血清m iRNA-26a表达水平对宫颈癌的预测价值

刘曼曼，李 静，王金铭，张 展，杜明泽，王碧君，管一春，刘朝朝

11)郑州大学第三附属医院生殖中心郑州450052 2)郑州大学第三附属医院妇产科郑州450052 3)郑州大学第三附属医院检验科郑州450052

宫颈癌，又称子宫颈癌，是常见的妇科恶性肿瘤，约占女性癌症死亡总数的8%，约80%的宫颈癌发生在发展中国家［1-2］。人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)属于乳头多瘤空泡病毒科乳头瘤病毒属。高危型别HPV(如HPV16、18)的持续感染是促使宫颈癌发生的最重要因素［2-3］。miR-26a是最近发现的一种miRNA，本课题组的前期研究［4］已证实在HPV18阳性的宫颈癌HeLa细胞和HPV16阳性的宫颈癌SiHa细胞中，miR-26a能够通过靶向调控高迁移率蛋白A1基因(high mobility protein A1，HMGA1)的表达，抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭，参与宫颈癌的发生发展。本研究检测了miR-26a在HPV高危型宫颈癌患者癌组织和血清中的表达水平，探讨血清miR-26a表达水平对宫颈癌的预测价值。

1 对象与方法

1．1 研究对象 收集2014年12月至2018年10月在我院就诊的HPV16和(或)HPV18阳性的宫颈癌患者50例作为病例组，患者入院后行宫颈活检或行筋膜外/广泛性子宫切除术，术前均未接受放、化疗;FIGO分期Ⅰ、Ⅱ期31例，Ⅲ、Ⅳ19例;鳞癌43例，腺癌7例;临床分级中高分化35例，低分化15例。收集同期HPV16和(或)HPV18阳性、因良性病变(如子宫肌瘤、子宫腺肌病、子宫内膜息肉等)行子宫全切或宫颈活检的非宫颈癌患者50例作为对照组。两组临床基本资料比较，差异无统计学意义(表1)。本研究已经通过医院伦理委员会批准，患者均签署了知情同意书。

表1 两组患者临床基本资料比较 例

1．2 标本收集 ①患者空腹，使用凝血管采集肘部静脉血，2 h内分离血清。采血后轻轻倒转采血管4～5次，直立置于室温待血液完全凝固，1 000 r/min离心10 min，分离血清，转移至专用冻存管中，于－80℃冰箱中保存。②将手术取得的宫颈组织处理干净，迅速放入液氮中，于－80℃冰箱中保存。

1．3 m iR-26a的检测 miR-26a、小核 RNA6(U6)特异性引物购于上海生工生物工程有限公司。Trizol试剂盒购于美国Invitrogen公司。实时荧光定量PCR试剂盒购自北京鼎国公司。取冻存的宫颈组织100 mg于液氮中研磨，或取冻存的血清标本100 μL，放入1．5 mL EP管中，Trizol一步法提取 RNA，异丙醇法浓缩RNA，用分光光度计测定总RNA纯度，甲醛变性凝胶电泳检测总RNA质量。采用实时荧光定量PCR试剂盒进行扩增。反应条件:95℃预变性30 s;95℃ 5 s;60℃ 30 s，40个循环。采用2－ΔΔCt法分析 miR-26a 表达水平。

1．4 统计学处理 采用SPSS 21．0对数据进行统计学分析。两组年龄构成、病史等的比较采用χ2检验或精确概率法，血清和宫颈组织中miR-26a表达水平的比较采用两独立样本的t检验。采用Pearson相关系数评价病例组血清和癌组织中miR-26a表达水平的相关性。绘制依据高危型HPV阳性者血清miR-26a表达水平诊断宫颈癌的ROC曲线，分析预测价值。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 两组血清和宫颈组织中m iR-26a表达水平的比较 病例组血清和宫颈组织中miR-26a表达水平均低于对照组，见表2。Pearson相关分析结果显示，病例组血清和宫颈组织中miR-26a表达水平呈正相关(rP=0．535，P ＜0．001)。

表2 两组血清和宫颈组织标本中m iR-26a的表达水平

2．2 血清m iR-26a表达水平对高危型HPV阳性患者宫颈癌的鉴别诊断价值 血清miR-26a表达水平诊断高危型HPV阳性者发生宫颈癌的ROC见图1。曲线下面积为 0．887(95%CI=0．808 ～0．941);诊断界点取3．94时，敏感度为78．0%，特异度为88．0% 。

图1 血清m iR-26a表达水平预测高危HPV阳性者发生宫颈癌的ROC

3 讨论

HPV是一种环状的双链DNA病毒，核心是由7 800～7 900个碱基对以共价键形式组成的含有遗传信息的闭合环状双链DNA，外围由72个壳粒包被，形成对称的20面体［3，5］。HPV 根据其生物学特征和致癌潜能，分为高危型和低危型。高危型HPV的E6和E7基因编码的原癌蛋白是引起宫颈癌发生的重要因子［3，5］。E6 蛋白能够通过 E6-AP 特异性结合P53蛋白，导致P53蛋白快速降解，促使细胞周期失控。E7蛋白和pRb具有高度亲和性，可以促使E2F和pRb复合物解离，使G1期进入S期所需的基因(如DNA聚合酶α、c-myc)得以转录，从而促使细胞周期失控且发生永生化［2-3，5-6］。

miR-26a是新发现的一种miRNA，其抑癌基因作用在胃癌、肺腺癌等癌症中已经得到证实［7-8］。已有研究［9］证实miR-26a/Bad/Bax生物轴能够诱导多形性成胶质细胞瘤对替莫唑胺耐药，该效应通过缺氧介导的线粒体凋亡实现。有研究［7，10］表明同源框蛋白HOXC9可促进胃癌细胞的转移和干细胞样表型表达，而这些效应可被miR-26a逆转。小核仁RNA宿主基因6(SNHG6)是一种竞争性内源RNA，它能够与miR-26a-5p结合，从而影响E2F7蛋白的表达，参与细胞的生物学调控。也有研究［8，11］表明miR-26a/E2F7能够作为一条反馈环路，参与细胞的生物信息学调控。以上研究结果提示miR-26a可能通过影响E7蛋白的表达，调控E2F家族的表达，参与宫颈癌的发生发展。

本研究结果显示，高危型HPV阳性宫颈癌患者癌组织和血清标本中miR-26a的表达水平低于高危型HPV阳性的良性病变者，宫颈癌患者血清和癌组织中miR-26a的表达水平呈正相关;进一步的ROC分析结果显示，血清miR-26a表达水平对高危型HPV阳性的宫颈癌与良性病变具有一定的鉴别诊断价值，曲线下面积为0．887(95%CI=0．808 ～0．941)，诊断界点取3．94时，敏感度可达78．0%，特异度达88．0%。因此，我们认为血清miR-26a水平对高危型HPV阳性患者宫颈癌的发生具有一定预测价值。