CRISPR/Cas9技术的发展与应用

李沛哲

摘要：CRISPR/Cas9是一种用于靶向特定基因的DNA修饰工具，产生于细菌和古细菌，是一种适应性免疫系统，就像文字纠错软件，可以检测到病毒DNA并将其消灭并修复。经过不断发展，已有多个物种应用这一系统用于研究，还可能将应用于基因编辑的科研、临床治疗等，现已证明CRISPR/Cas9技术拥有一定优势，比如设计简单，操作容易，但是背后还存在道德伦理问题，以及该技术本身存在的问题如脱靶效应。

关键词：CRISPR/Cas9基因编辑疾病治疗免疫防御

1.研究背景

20世纪70年代DNA重组技术开始发展，这标志着生物学进入了一个新阶段。分子生物学家第一次获得了操纵DNA分子的能力，使研究基因和利用它们开发新的药物和生物技术成为可能。

广义来说，基因组工程指的是对基因组进行有针对性的修改、其上下片段（如表观遗传标记）或其输出（如转录本）的过程。在真核生物中，特别是在哺乳动物细胞中能够十分容易且有效地做到这一点，对改变基础科学、生物技术和医学有着巨大的作用

生物的遗传信息储存在基因中，蛋白质是由编码基因决定的。基因突变时，其编码的蛋白质的氨基酸组成也会改变，有些蛋白質会提前终止翻译，遗传疾病就会发生。特异性的修饰基因组靶点，可以用来治疗遗传病，人们研究修饰位点时，在细菌和古细菌中找到了某种 RNA，它可以用来标记位点，命名为gRNA。CRISPR/Cas9蛋白和gRNA彼此之间相互作用，使得切割都发生在正确的位置。

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种用于靶向基因特定DNA修饰的工具，细菌在其成长环境中需要不断对抗病毒，CRISPR指的是一种适应性免疫系统，其产生于细菌和古细菌，它们为了应对病毒的攻击而逐渐进化，产生了这种系统，在CRISPR作用之下，可以检测到病毒的DNA并将其消灭，该机制中，Cas9是一种蛋白质，作用是寻找并切断病毒的DNA，使其降解，crRNA（CRISPR-derived RNA）与tracrRNA（trans-activating RNA）会结合形成一种复合物，该复合物能特异性识别靶基因序列，引导Cas9核酸内切酶在定位点将双链DNA剪断，然后，其非同源末端与修复机制相连接，将重新连上断裂处的基因组DNA，精准插入特定的DNA片段，这就是说，假如能够造成双链断裂，则可以诱发细胞进行修复，方式为干预或融入新基因，另外还有一种修饰DNA的方法即将外源DNA的一个片段整合进断裂处。

基于CRISPR-associated RNA引导的核酸内切酶Cas9的基因组工程技术的最新进展，让我们有机会对哺乳动物基因组系统功能进行探究。就像文字纠错软件，Cas9可以通过短的RNA字符引导到复杂基因组中的特定位置并修改错误。这一系统使得内源性基因组内的DNA序列及其功能输出可以所有有机体中轻松调控或编辑。这篇综述描述了CRISPR/Cas9技术的发展与应用，同时强调了存在的问题以及未来的展望。

2.CRISPR的发展历程

CRISPR的研究开始于1987年，Nakata和同事在研究大肠杆菌中参与碱性磷酸酶同工酶转化的iap酶时，报告了iap基因下游29个nt重复序列并不像大多数重复的元素，采取串联重复的形式，这29个nt重复被5个中间的32个nt非重复序列间隔。在接下来的10年里，随着更多的微生物基因组被测序，从不同细菌的基因组中报告了更多的重复元素。Mojica和他的同事最终将间隔重复序列作为一个独特的重复元素家族进行了分类。2007年，研究表明，以增添或消除与噬菌体DNA相匹配的间隔区DNA这一方式，可以达到改变嗜热链球菌对噬菌体的抵抗力的目的。2011年科学家着手研究与CRISPR相关的蛋白质的各种功能，并且成功分离出了Cas9蛋白质的CRISPR系统，这项研究解释了间隔区 DNA是如何在细菌免疫防御中发挥作用的。2013年，两项研究同时展示了如何从嗜热链球菌和脓链球菌中成功构建II型CRISPR系统，达到哺乳动物细胞的基因组编辑目的。成熟crRNA-tracrRNA杂交体的异体表达，还有sgRNAs指导哺乳动物细胞基因组中的Cas9裂解，会刺激NHEJ基因组编辑。多个引导RNA也可以同时用于定位多个基因。自此，Cas9已被数千家实验室用于各种实验模型系统的基因组编辑应用。Cas9技术的迅速应用也通过开源分销商和一些在线用户论坛而大大加快。

从发现到2013年系统的建立，CRISPR在多种物种中已经得到应用，并且用于应用的物种的数目还会继续增加。

3.CRISPR的工作原理

尽管科学家到现在为止还没有彻底发掘CRISPR/Cas9系统的具体的作用机制，但该系统的作用过程已基本清楚，即大致分为以下3个阶段。

（1）当病毒感染细胞时，病毒携DNA进入细胞，在一个细菌体内，CRISPR会将病毒内的 DNA抽出，然后以碎片的形式插入细菌 DNA中，其基因组裂解。

（2）Cas9与RNA的复合体切断基因组中的双链间隔序列，再整合至宿主基因组，其中较短的参入间隔序列转录，因而crRNAs产生。

（3）细胞有能力寻找断链的DNA，并对其进行修复，是在Cas蛋白复合物的参与下，靶向干扰噬菌体的基因组序列。

4.CRISPR/Cas9技术在疾病研究中的应用

4.1疾病模型的构建

现如今，大多数遗传病的研究是通过对患者的iPS细胞的研究来实现的，这会耗费大量时间，同时也受到细胞是否可以得到和遗传背景多样性的限制。现在研究者已经发现了新的可以模拟阿尔兹海默症的疾病表现的方法，正是利用CRISPR/Cas9技术，可以将一种阿尔兹海默症的遗传突变引入，在引入突变的位置和切割的位点之间，他们发现存在一段序列距离，而干细胞基因组的编辑就可以用到这种距离关系，因此，研究人员将干细胞基因组加以编辑，疾病基因就成功包含在干细胞中，再利用诱导技术，干细胞转化为神经元细胞，这就起到了模拟疾病的作用。

4.2疾病的治疗

目前，病毒治疗的方法尚且缺乏，但是 CRISPR/Cas9系统给治疗病毒提供了新的方法，当DNA中出现了一个双链断裂时，就可以引入修复机制，其效果也十分显著，比如纠正镰状细胞贫血突变基因，另外研究表明HIV病毒可以利用CRISPR/Cas9技术从体外培养的人体T细胞中有效清除。遗传病防治中，血友病B非常适合基因治疗和基因编辑技术，GuanY等人发现人的F9基因上的突变Y371D引起的血友病比突变Y371S更加严重，通过靶向这一基因位点的CRISPR/Cas9系统，他们对小鼠加以治疗，结果显示，当以腺病毒为载体时，基因编辑系统的纠正率较高，但是因为肝毒性十分严重，因此还要进一步改进。

人们还在研究如何利用CRISPR/Cas9技术治疗癌症，经过研究发现，敲除相关基因会是一个十分有效的方法。在2015年，正是利用了CRISPR技术，人类关于癌症的治疗有了重大突破：利用一种慢病毒载体，研究者发现 CRISPR系统会被doxycycline诱导表达，细胞的编辑也十分高效，而最关键的是癌基因 MCL-1被成功敲除，且包括体内和体外两种环境都得以实现。自此，肿瘤治疗迎来了新的机遇，利用敲除癌基因这一技术，人们有机会在未来将其用于临床治疗。

5.Cas9的应用优势

首先，CRISPR/Cas9技术的一大应用就是可以用来对菌种进行分类，得益于其重要特性，分类效果显著提高;第二，CRISPR/Cas9系统会构成特异性的单链切口，这与遗传学中常常使用的人工核酸酶（ZFN或TALEN）有所不同，细胞的同源重组会被其有效激活，这就展现了与原有技术相比更有利的一面。第三，对CRISPR/Cas9进行多个位点修饰途径，达成较长片段缺失的突变改造机制，这给长期困扰人们的遗传病的治疗提供了新思路。

如果能充分利用CRISPR/Cas9系统及其相关的基因编辑技术，很有可能使人们渐渐接受转基因这一至今仍备受争议的技术，转基因的动植物，比如一些重要的家畜，我们可以利用CRISPR/Cas9技术修饰它们的基因组，使其表现出更优良的性状，现在，研究人员已经可以利用这一技术改良和提高绵羊的肌肉含量，还有家猪的瘦肉率等等。

6.存在的问题

基因编辑引发了不少道德伦理方面的问题，这是因为这项技术不仅可以应用于成人细胞上，还可以用在一些生物体的胚胎身上，包括我们人类本身。另外，脱靶现象也是科学家正在研究和尽力控制的一个问题。

何为脱靶？最开始，人们普遍认为 CRISPR/Cas9若想要切割一段DNA序列，就必须与DNA所携带的速查表能够完全匹配，不过现如今已经证实这一想法并不是正确的。与靶DNA相近的DNA序列有时也会被切割，但是这些序列却含有与靶DNA不相同的碱基，且数目较大。研究者发现CRISPR/Cas9这一脱靶现象会对细菌产生有利影响，使它们能够免受病毒攻击，因为CRISPR/Cas9系统可以跟踪不断变异的病毒的进化过程，但是对人类是无益的，一旦脱靶，人类的遗传物质就会被破坏，这将造成十分严重的影响。

7.展望

CRISPR/Cas9是一种较为安全的“剪刀”，会给临床治疗提供一个崭新的思路，随着 CRISPR/Cas9系统的发展和普及，不仅可以用于科研的基因编辑领域，还可以用來治疗疾病，减少食品安全问题等等，在接下来的10年中，我们将看到这项技术在临床上的应用，尤其是适用于成年人身上的应用，我们会看到很多临床试验，甚至还有可能被批准用于治疗，正是因为这项技术的优越性，很多新公司打算要将它商业化，也会有很多的投资者表现出对这些公司的兴趣，但不得不考虑的是这项技术还应该可以深度优化，尤其是当我们知道了关于人类的一些基因信息，CRISPR就提供了一种工具，这就会引起一系列道德伦理问题，需要我们认真对待。我们所有人都有责任去考虑这项技术背后的预期和非预期后果。

（作者单位：四川农业大学）