UV-B辐射对不同生态型垂穗披碱草幼苗生长和抗氧化酶系统的影响

2019-09-25刘博文田沛鑫文素芸张旭虎苗彦军许岳飞

草地学报 2019年4期

刘茜，刘博文，王洋，奥宝，田沛鑫，文素芸，张旭虎，苗彦军，许岳飞*

(1. 西北农林科技大学草业与草原学院，陕西杨凌 712100； 2. 西藏农牧学院植物科学学院，西藏林芝 860000)

紫外辐射是指波长范围为10～400 nm的非照明光辐射。在该波长范围内根据不同波长和其所引起辐射效应的不同，将紫外辐射分为UV-C(100～280 nm，短波)、UV-B(280～320 nm，中波)及UV-A(320～400 nm，长波)。西藏位于我国青藏高原地区的西南部，地形复杂多样，海拔较高，大气稀薄，是中国太阳辐射能最多的地方。而且平流层的臭氧量降低明显，臭氧层吸收紫外辐射的能力大大减弱，导致到达地面的UV-B明显增加。据有关资料显示，拉萨当地夏季晴空时的UV-B辐射强度可达6.0 W·m-2，其紫外辐射强度远高于平原地区[1-2]。然而光照作为植物生长发育必需的能量来源之一，其对植物的生长发育、生理生化和形态结构等方面都有着极其重要的影响，故研究该地区的紫外辐射具有十分重要的意义，尤其是关于UV-B对高等植物的形态、生物量积累等进程的影响[3-4]。

垂穗披碱草(Elymusnutans)是禾本科(Poaceae)披碱草属(Elymus)的一种多年生草本优质牧草[5]，分布于我国的西藏和西北等地区，且常在青藏高原地区海拔2 500～4 000 m的草地中担任建群种的重要角色[6]，具有产量高、适口性好、适应性强和生长可塑性广泛等优良特性，鉴于其良好的生态和经济价值，已被引入栽培利用[7]。垂穗披碱草还有着很好的抗逆性，例如抗病、抗虫、抗旱、耐盐等优良抗逆基因。而关于垂穗披碱草抗UV-B辐射方面的研究较少[8]，但UV-B辐射对其他植物的影响已有研究报道，如水稻(OryzasativaL.)、甘草(GlycyrrhizauralensisF.)和大麦(HordeumvulgareL.)等[9-11]。UV-B辐射的相关研究普遍认为：植物在经受UV-B辐射后生物量的积累和光合系统会受到影响[12-13]，并且植物体内的抗氧化酶系统也会进行一系列反应来减轻或避免活性氧对细胞膜的伤害。研究认为超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase，GR)等抗氧化酶活性可作为植物抗逆性生理评价的重要指标，辅以细胞渗透调节物质丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量、脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX)活性和可溶性蛋白含量等指标来进行综合分析，能更准确地对植物的抗UV-B辐射进行评价。因此本研究以2份不同生态型垂穗披碱草的幼苗为研究对象，采取人工模拟UV-B辐射处理，测定UV-B辐射对这2份垂穗披碱草幼苗的生物量、光合色素含量、渗透调节和抗氧化酶产生的影响变化，旨在为优良牧草的繁育和品种的改良提供技术支持和理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料与实验设计

本实验于2014年10—11月在西北农林科技大学草业科学系实验室进行。试验所用的野生型垂穗披碱草种子(XZ)是于2012年9月采自于西藏申扎县(91°41.960′ E，31°06′187′′ N)，商用型垂穗披碱草种子(ZD)是购自于北京正道生态科技有限公司。供试种子经0.1%(W/V)次氯酸钠溶液消毒，由蒸馏水冲洗数次后置于湿润的石英砂(事先已高温灭菌)培养皿中，并放置在人工气候箱(MGC-450HP上海天呈实验仪器制造有限公司；光通量密度200 μmol·m-2·s-1、光期16 h、温度25℃、湿度70%；暗期8 h、温度20℃、湿度60%)中进行培养。7 d后选择生长整齐一致的幼苗分别移入黑色育苗盆(口径为5×5 cm，深度为10 cm，总体积为100 mL)中，基质为已灭菌的石英砂，每盆3株，移植深度为2 cm。随后，将移植好的石英育苗盆置于人工气候箱中培养21 d，期间幼苗每3 d更换一次Hoagland营养液。21 d后，2个生态型的垂穗披碱草幼苗均分别接受UV-B(标记为ZD+和XZ+)和作为对照的正常光照处理(标记为ZD-和XZ-)，采用完全随机试验设计，在2个相同人工气候箱中分别实施UVB处理和对照光照处理，每处理重复3次。在每天8:30～16:30使用12根40 W 1.2 m UV-B荧光灯对每个处理进行照射，其余时间为正常光照(与育苗期人工气候箱参数相同)。处理组用0.125 mm厚的二醋酸纤维素薄膜包裹过滤UV-C照射，为紫外处理组的幼苗提供UV-B照射，使处理组UV-B辐射水平为7.0 KJ·m-2·d-1，此辐射水平与Fisher (2007)等人关于UV-B辐射对冬小麦的研究中所使用的辐射剂量相同[14]。UV-B辐射采用紫外辐照计(TN-2340 紫外辐照计(UV-A/UV-B))在植株顶端部进行测量。其他培养条件各组均一致。处理7 d后对幼苗进行相关指标的测定。

1.2 测定项目及方法

每个处理选取完整的植株，分别取每株植物的地上和地下部分，用自来水洗净，再用蒸馏水冲洗3遍，吸干水分，于105℃杀青30 min，70℃下烘干至恒重测定其干重，其对应比值为根茎比；叶片色素含量的测定参照许大全[15]的方法；丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法[16]；氧自由基产生速率采用Elstner Heupel等[17]方法测定；可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法[18]；测定脂氧化酶(LOX)活性参照石胜尧的方法[19]。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)法[20]测定。过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外光度法[21]测定。过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法[22]测定。谷胱甘肽还原酶(GR)活性采用Foyer and Halliwell法[23]测定。

1.3 数据处理与分析

试验数据采用Excel 2016对原始数据进行处理，以SPSS 22.0进行双因素方差分析，使用Duncan’s法对平均值进行多重比较，作图采用SigmaPlot 12.5软件完成。

2 结果分析

2.1 UV-B辐射对2份垂穗披碱草幼苗生长的影响

垂穗披碱草的生态型种类和UV-B水平的交互效应对其地上生物量的影响未达到显著水平，但对地下生物量和根茎比影响显著。由图1-A可见，不同生态型之间和UV-B水平之间的地上生物量均有显著差异(P<0.05)：经UV-B辐射的地上生物量显著下降了14.2%；而且XZ幼苗的地上生物量显著低于ZD 15.2%；ZD在经受UV-B辐射后幼苗的地下生物量(图1-B)和根茎比(图1-C)较对照分别显著下降了61.7%和56.1%(P<0.05)，而XZ经UV-B辐射后地下生物量(图1-B)和根茎比(图1-C)均无显著性变化。可见UV-B对XZ垂穗披碱草幼苗影响较小，对ZD垂穗披碱草幼苗的影响较大。

图1 UV-B对垂穗披碱草幼苗地上生物量(A)、地下生物量(B)和根茎比(C)的影响Fig.1 Effects of UV-B on above-ground biomass (A),below-ground biomass(B) and root-shoot ratio(C) of two ecological types of E. nutans注：-UV-B：无UV-B辐射处理；+UV-B：UV-B辐射处理；ZD-：ZD-UV-B；ZD+：ZD+UV-B；XZ-：XZ+UV-B；XZ+：XZ+UV-B；不同字母标记的平均数间差异显著(P<0.05)；ns表示差异不显著；*,**和***分别表示0.05，0.01和0.001水平差异显著；下同Note:-UV-B:without UV-B radiation treatment;+UV-B:UV-B radiation treatment;ZD-:ZD-UV-B;ZD+:ZD+UV-B;XZ-:XZ+UV-B;XZ+:XZ+UV-B;Different lowercase letters in the figure indicate significant difference at the 0.05 level;ns:not significant;*,** and*** indicate significant difference at the 0.05,0.01 and 0.001 level,respectively;the same as below

2.2 UV-B辐射对垂穗披碱草幼苗光合色素含量的影响

由图2可知，不同生态型种类和UV-B水平的交互效应对垂穗披碱草光合色素含量的影响并未达到显著水平，但对各光合色素含量影响各不相同。其中UV-B辐射显著影响了了2份垂穗披碱草幼苗的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素的含量和叶绿素a/b值，但对类胡萝卜素(图2-C)的含量影响却未达显著水平。具体表现为：与对照组相比，UV-B辐射处理7 d后垂穗披碱草叶绿素a的含量显著降低了11.8%(P<0.05)，叶绿素b含量显著降低了16.8%(P<0.001)，总叶绿素含量显著降低了12.8%(P<0.01)，叶绿素a/b值则显著增加3.9%(P<0.05)。不同生态型间的垂穗披碱草仅叶绿素b含量的差异显著，以ZD显著高于XZ的80.3%。

图2 UV-B对垂穗披碱草幼苗光合色素的影响Fig.2 Effects of UV-B on chlorophyll concentration of two ecological types of E. nutans

2.3 UV-B辐射对垂穗披碱草幼苗丙二醛含量和超氧阴离子自由基产生速率的影响

UV-B辐射水平和垂穗披碱草的生态型种类对于MDA含量和产生速率的影响不存在显著的交互效应，但是不同光照条件和不同生态型对垂穗披碱草幼苗MDA含量的影响均达到了显著水平(P<0.001)，UV-B辐射处理显著提高了垂穗披碱草的MDA含量(图3-A)，而ZD的MDA含量显著高于XZ的93.2%。然而UV-B辐射处理对的产生速率影响则无显著差异(图3-B)，但不同生态型间差异显著(P<0.05)，以ZD显著高于XZ的25.4%。

图3 UV-B对垂穗披碱草幼苗MDA含量(A)和产生速率(B)的影响Fig.3 Effects of UV-B on MDA content (A) and generation of (B) of two ecological types of E. nutans

2.4 UV-B辐射对垂穗披碱草幼苗可溶性蛋白含量和脂氧合酶活性的影响

UV-B辐射水平对2份不同生态型垂穗披碱草的可溶性蛋白含量(图4-A)和LOX活性(图4-B)产生了不同的影响。不同生态型间垂穗披碱草的可溶性蛋白含量(图4-A)没有显著差异，但不同的UV-B辐射水平对可溶性蛋白含量的影响差异显著(P<0.01)，以有UV-B辐射显著高于正常光照7.0%。UV-B辐射对2份垂穗披碱草幼苗的LOX活性(图4-B)却有着不同的影响。表现为：在UV-B辐射7 d后，ZD幼苗的LOX活性(图4-B)较对照显著提高了105.5%(P<0.05)，但XZ幼苗的LOX活性在经受UV-B辐射后均无显著性变化。

图4 UV-B对垂穗披碱草幼苗可溶性蛋白含量(A)和LOX活性(B)的影响Fig.4 Effects of UV-B on soluble protein content (A) and LOX activities (B) of two ecological types of E. nutans

2.5 UV-B辐射对垂穗披碱草幼苗4种抗氧化酶活性的影响

方差分析结果表明，2因子互作效应对4种抗氧化酶活性的影响均不显著(图5)。不同光照类型间SOD(图5-A)和POD(图5-C)活性均没有显著差异，而2个不同生态型间SOD和POD的差异却都达到了显著水平，以XZ的平均SOD活性显著地远远高于ZD(P<0.001)，而ZD的POD显著高于XZ的81.4%(P<0.05)。然而，CAT和GR(图5-D)活性在2个不同生态型间没有显著差异，而在2个光照类型间差异显著(P<0.05)，以有UV-B辐射的POD活性显著高于正常光照29.6%，而正常光照的GR活性显著高于UV-B辐射38.3%。

图5 UV-B对垂穗披碱草幼苗对SOD(A)、POD(B)、CAT(C)和GR(D)活性的影响Fig.5 Effects of UV-B on the SOD(A),POD(B),CAT(C)and GR(D) activities of two ecological types of E. nutans

3 讨论

UV-B辐射是牧草生长的重要应激因子，对牧草的生长生理有着不同的影响。

许多研究发现，UV-B辐射能明显影响到植物生长和生理状态，植物可做出一系列应激反应来适应UV-B辐射[24]。其中生物量是衡量植物受到逆境胁迫时的重要生理指标，其变化反映了植物对不利环境因素的敏感性和耐受性程度。前人的研究发现，在受到UV-B辐射后植物的生物量积累会受到影响，其地上与地下生物量的分配也会发生变化，植物会将生物量的积累转移到地上部分，从而出现根茎比降低等现象[25]，这与本试验UV-B显著降低ZD垂穗披碱草幼苗地下生物量和根茎比的结果相似，并且UV-B降低了地上生物量，这可能是因为ZD垂穗披碱草幼苗在尽可能地修复植物地上部分以保留碳源，从而抵御不良环境。试验结果中UV-B辐射对XZ的地下生物量和根茎比影响较ZD小，可能是由于其长期在自然条件下的进化使之更耐受于UV-B。

光合作用是绿色植物形态建成和生长发育的基础，植物叶片中光合色素的含量变化直接影响到植物光合作用，包括植物对光能的吸收、传递和转化。而逆境环境会破坏植物的光反应和光合色素等来降低植物的光合作用的反应速率。大量研究认为UV-B辐射后植物的光合色素合成受到抑制而出现含量下降，从而导致光合作用降低。这与本试验的结果相符：UV-B辐射处理影响了2份垂穗披碱草幼苗的光合色素含量，其中UV-B辐射对垂穗披碱草幼苗的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量和叶绿素a/b值的影响均有显著差异。有研究分析这种现象可能是UV-B辐射导致供试垂穗披碱草幼苗的叶绿体部分结构和功能发生改变，从而使叶片光合色素含量受到影响造成的[26]。相关研究结果表明UV-B可使绿色植物的叶绿素a含量出现显著降低[27]，而这与本研究中叶绿素a含量的变化不相符，这可能与两个研究中植物的种类不同和其所处生长发育阶段不同有关系。另外，与对照相比，UV-B辐射依然对XZ的光合色素含量影响较小，可见XZ幼苗比ZD幼苗更耐受于UV-B辐射。

植物的生物膜透性对于逆境的反应比较敏感，植物的抗逆性也与之密切相关。MDA是膜脂过氧化的主要产物，是鉴定植物细胞膜结构受破坏程度的重要衡量指标之一[28]，而其含量与产生速率有关[29]，会对植物生物膜造成极大威胁，且会使植物体内正常代谢平衡被破坏。本试验中，UV-B辐射处理7 d后2份垂穗披碱草的MDA含量和产生速率不同程度地升高，其中MDA含量均出现显著增加，而产生速率均有提高但并未达显著水平。该现象可能是由于UV-B辐射破坏了垂穗披碱草幼苗的细胞膜结构所致，从而使幼苗的生物膜脂质过氧化加剧，故其产物MDA含量也呈增加趋势。但XZ垂穗披碱草升高的较ZD少，可见UV-B辐射对XZ垂穗披碱草细胞膜透性的伤害较轻。

植物体内可溶性蛋白质含量亦可反映植物抗逆性能力的大小。由于可溶性蛋白有着较强的持水力，其含量增多可以降低细胞渗透势，保持和稳定大分子物质，维持细胞膜的正常功能[30]可以在植物经受逆境时起保护作用。本试验中经UV-B辐射处理的2份垂穗披碱草的可溶性蛋白含量也均有增加，但是不同生态型间差异却并未达到显著水平。而LOX亦能促进各种细胞膜不可逆损害的修复[31-32]。本试验结果显示ZD垂穗披碱草的LOX活性显著增加，可能是由于其抗UV-B性较弱所以其植物组织在受到伤害作出的应激反应较强，这与菜豆(PhaseolusvulgarisL.)在受到逆境时的LOX变化结果相一致[33]。同样，UV-B处理下XZ幼苗的可溶性蛋白含量和LOX活性的变化幅度小于ZD，可见其具有较好的抗UV-B辐射性。

通常植物对逆境抵抗能力也与体内的抗氧化酶活性水平关系密切。在逆境下SOD、POD、CAT以及其它酶类相互协调，有效地清除代谢过程产生的活性氧，使生物体内活性氧维持在低水平上，从而防止了活性氧引起的膜脂过氧化及其它伤害过程。生物体内SOD活性高低是植物抗逆性的重要标志之一，其主要是将歧化成H2O2，而POD和CAT在植物清除体内自由基过程中的第二步起主要作用，将转化成的H2O2进一步分解为H2O，从而消除H2O2对细胞的毒害[34]。而GR主要通过参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环而在细胞活性氧的清除中起重要作用，并与SOD、APX等相互作用共同清除植物体内多余的活性氧。Kataria等人[35]通过研究发现，UV-B辐射显著增强了叶片的SOD和POD活性。还有研究表明UV-B辐射可使芦苇(Phragmitescommunis)叶片的SOD、CAT和GR活性出现显著升高[36]。本试验供试的2份垂穗披碱草幼苗在UV-B辐射后，SOD活性的变化未达到显著水平；然而其中XZ垂穗披碱草幼苗的SOD平均活性远高于ZD，且二者间差异达到极显著水平；2个垂穗披碱草受UV-B辐射后的POD活性差异也并不显著，CAT和GR的活性在UV-B处理下分别出现了显著降低和显著提高，且以ZD垂穗披碱草幼苗的变化最为显著，可能是ZD体内较低的SOD活性和较高的产生速率共同作用而致。而结果中二者的GR活性则均呈现出增加趋势的现象，与许多前人研究得出的结果[35,37]类似，这也是GR积极响应植物机体代谢途径从而保护植物不受氧化胁迫的体现。垂穗披碱草体内的抗氧化酶活性水平与抗UV-B辐射的能力有关，从抗氧化物酶水平受UV-B辐射的影响程度来看，也是XZ垂穗披碱草的抗UV-B辐射能力更强。