发酵液预处理过程的特性

秦 振，董 楠，杨 林，廖岩峰

(天方药业有限公司，河南 驻马店 463000)

林可霉素(lincomycin)(图1)[1]是一种高效广谱抗生素，于1962年由美国人Mason等首先从链霉菌林可变种培养液中获得，从此获得广泛应用。林可霉素分子式为C18H34N2O6S，相对分子质量为406.56。

图1 林可霉素结构式Fig.1 Lincomycin structural formula

目前在世界上发酵培养是抗生素生产的主要方法，各国都在广泛应用。由于在发酵液中存在着大量菌丝体的同时，还存在着菌体的代谢物，剩余培养基以及抗生素主组分以外的其它复杂组分。所以，在抗生素提取精制之前，必须进行预处理、过滤，以除去这些干扰物质[3-4]。

目前对于发酵液的处理方法，有带菌丝体萃取、双水相法、树脂离子交换法、膜分离以及板框过滤法等，以上各种方法都各有优缺点。板框过滤法因其技术要求简单，操作简便因此被我公司采用。

发酵液在过滤前需要进行预处理。通过预处理改变发酵液的物理性质以利于固液分离。预处理常用的方法有pH、温度调节、絮凝等。对于不同的抗生素产品其预处理的具体主法不同。本文主要以林可霉素为例，对发酵液的预处理方法和效果进行研究。

1 实验方法

1.1 pH值调节的影响

常温下取林可霉素发酵液，升至适当温度后用草酸将发酵液调至适当pH值，测定滤速(mL·5min-1)。取数份体积相同的预处理(pH值为2.8)，将其回调到不同的pH值，搅拌均匀后用滤纸过滤，分别测定各滤液效价和滤速。

1.2 温度调节的影响

取林可霉素发酵液，加入草酸将pH值调至2.8后，接着加入适量的硫酸锌和黄血盐，最后在不同的温度下过滤，分别测定各滤液效价和滤速。

1.3 外加物质的影响

取林可霉素发酵液，加入不同含量的硫酸锌和黄血盐，搅拌30 min后过滤，测定滤液效价、蛋白质含量(以沉淀物计算)和过滤速度。

以上实验所用的林可霉素发酵液由天方药业有限公司林可生产车间提供。

2 实验结果和讨论

2.1 预处理pH值对过滤的影响

在水溶液中抗生素存在着解离平衡，pH值的高低影响着解离平衡。取林可霉素发酵液分别调到不同的pH值(pH值=2～8)，测定滤液效价的不同变化。

实验结果见图1。通过对比实验结果发现，在不同的pH值下过滤后的林可霉素发酵液效价存在峰值。同时在实验过程中也发现，pH值对林可霉素发酵液的滤速、蛋白质含量的影响都比较大。在pH值<3.5时过滤后蛋白质的析出量较多，最大可达到110 mg(10 mL滤液)-1(见表1)，说明在过滤过程中较低的pH值使滤液中碱性蛋白质的析出量增加。

图1 林可霉素滤液效价与pH的关系图Fig.1 Lincomycin filtrate titers and pH relationship diagram

表1 pH值对滤速与蛋白质含量影响Table 1 pH on the filtration rate and protein content

为了研究pH值<3.0时效价降低现象及过滤pH值对后续萃取过程的影响。在接下来又做了对pH回调后对滤液的影响实验：取林可霉素发酵液先调节pH值至3.0，然后再分别回调至pH值=3.0～7.5，测定滤液效价变化(见图2)。实验发现，随着pH值回调不断的上升，滤液效价呈下降趋势，其具体表现与图1相似，但是滤液的滤速变化小，蛋白质的析出量逐渐减小，并趋于一定值(见表2)。

图2 pH值回调后对效价的影响Fig.2 pH callback on the impact of price

从以上实验我们可以看出，滤液的效价只与最终的pH值有关，同实验过程中的pH调节关系不大， 这说明林可霉素浓度与pH值之间存在着一定的平衡关系，林可霉素在溶液和固形物之间存在着一种吸附平衡。发酵液中存在着多种蛋白质，不同的等电点下蛋白质的含量差异比较大，林可霉素是在偏酸性的条件下进行过滤，此时基本上不会析出碱性的蛋白质。当pH值上调到9.5左右时蛋白质会大量析出，此时易造成乳化现象，使分相出现困难。蛋白质在溶液中存在着溶解平衡和变性问题，出现这种现象的影响因素较多，计算比料复杂，通过实验发现，过滤时如果pH值高于6.5滤液中的碱性蛋白质的含量会比较少。

表2 pH对滤速与蛋白质含量影响Table 2 pH on the filtration rate and protein content

2.2 温度调节的影响

林可霉素发酵液过滤速率受温度的影响，因此我们做了温度对发酵液过滤速度的影响实验，取放罐发酵液分别调节温度(30～80℃)，测定滤液效价及滤速的变化。实验结果见图3。实验发现，过滤林可霉素发酵液时温度越高滤速越高，但滤液效价随着温度的升高而降低。通过实验我们可以发现，温度对发酵液的滤速和效价影响都非常的大。

从图3我们可以看出随着温度不断的提高，发酵液效价随着降低，但是发酵液的滤速却不断提高，然而随着温度再进一步的升高，滤速会趋于一稳定值。

2.3 外加物质的影响

图4 外加物质对滤速、效价和蛋白质含量的影响Fig.4 Effects of added substances on filtration rate,titer and protein content

在恒定温度和pH值的条件下加入不同量的外加物质(黄血盐和硫酸锌1∶1配比)，测定林可霉素发酵液效价和滤速。实验结果见图4。实验发现，在林可霉素发酵液中加入不同量的黄血盐和硫酸锌对林可霉素效价影响不大，但对蛋白质含量和发酵液滤速的影响较大。

由图4可看出，随着外加物质浓度的增加，林可霉素效价基本维持在一稳定值，说明外加物质的加入对效价影响不大；但发酵液的滤速则不断提高，最后趋于一稳定值，说明外加物质的加入可提高发酵液的滤速；而外加物质增加则可降低蛋白质含量，但在生产中需考虑生产成本问题，所以外加物质可控制在0.15%～0.3%最佳。

2.4 染菌对提取的影响

林可霉素提取的影响因素除了pH值、温度和外加物质外，染菌对提取的影响也非常的大。

2.4.1 对过滤的影响

发酵罐因染杂菌后，发酵液黏度加大，造成提取板框过滤时间拉长，影响设备的周转使用；因为黏度大，滤渣残留量也加大，破坏生产平衡，且降低过过滤收率。

2.4.2 对有机溶剂萃取的影响

染菌的发酵液含有大量的水溶性蛋白质，更易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开。

2.4.3 对离子交换的影响

杂菌会粘在树脂表面或被树脂吸附，从而降低离子交换树脂的交换性能。

2.4.4 对产品质量的影响

如果染菌会造成发酵液中出现较多的蛋白质和其他的杂质，会对产品的纯度造成较大的影响；同时可能会产品的外观造成影响。

2.4.5 杂菌对“三废”处理的影响

染菌后的发酵废液，生物好氧量(COD)增高，增加三废治理时间和成本。

2.5 提高异常发酵罐产品质量的方法

(1)针对异常发酵罐放罐发酵液要多做小试，找到黄血盐与草酸两种物料的比例。

(2)在生产投料时，要分多次加入，且每次都要做小试，尽量找到最佳点。

2.6 降低药渣残留的方法

(1)滤液过滤时不能使板框的压力过高，压力控制在0.2～0.25 MPa，便于洗水。

(2)对各级板框之间的压力也要做出调整，压力控制在0.2～0.25 MPa，并注意末尾板框压力。

3 结论

(1)在抗生素的发酵液中存在着电离平衡，同时在发酵液中固形物和蛋白质在沉淀过程中也会存在吸附平衡，各种预处理方法都会对上述平衡造成一定的影响。

(2)由于蛋白质在不溶液中存在着变性和溶解平衡，采用不同的温度和pH滤液中的蛋白质含量和滤速会出现不同。

(3)染菌不仅仅对发酵效价影响较大，对后面提取的收率和产品质量影响也很大，降低染菌率可以提高收率和产品质量。