DMSO与DMF对H9C2心肌细胞毒性及STAT3信号通路的影响

杨 敏，张 凯，李建喜，王 磊，张 康，仇正英，王学智

(中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃 兰州 730050)

H9C2心肌细胞用于筛选临床药物时，常面临药物溶解度低的问题，因此筛选助溶剂是溶解药物的关键一步。助溶剂必须满足低毒、助溶效果优良、不改变药物本身的特性。二甲基亚砜(DMSO)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为较常用的有机助溶剂。DMSO是一种广泛使用的可溶于水的非质子溶剂，增溶能力强，低毒，具有透过生物膜的能力，可诱导细胞发生凋亡[1-2]。DMF则作为最有效的极性溶剂之一，有很好的溶解性，高沸点，低毒性，价格低廉，在有机合成、高分子制备、制药等领域广泛应用[3]。DMSO与DMF都具有低毒性，但对H9C2心肌细胞的毒性作用有待进一步研究。近年来发现信号转导与转录激活因子3(STAT3)信号通路与心脏炎症、血管再生、肿瘤、新陈代谢密切相关，调节细胞增殖、分化、凋亡过程，在炎症反应中发挥作用，影响bcl-2、cyclinD1、matrix metalloproteinase-2基因转录活性[4-5]。当抑制STAT3活性时，可导致细胞凋亡，激活STAT3，进而抑制细胞凋亡[6]。DMSO与DMF对心肌细胞的毒性作用，可能与STAT3信号通路的调控相关。通过MTT法和Western blot试验，检测DMSO和DMF不同体积分数对H9C2心肌细胞的毒性作用与STAT3蛋白表达影响，以期为H9C2心肌细胞试验药物助溶剂的选择提供参考，为研究H9C2心肌细胞的STAT3蛋白通路相关领域提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂及药物

DMEM培养基、胎牛血清、双抗、0.25%的胰蛋白酶、无菌PBS，均购自美国Gibco公司；DMSO和DMF，购自美国SIGMA公司；MTT、彩虹180光谱蛋白Marker、5% BSA封闭液，均购自Solarbio公司；M-PER细胞裂解液，购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Beta Actin Mouse McAb抗体，购自美国Proteintech公司；STAT3兔单克隆抗体，购自美国Cell Signaling Technology公司；Bcl-2兔多克隆抗体，购自美国Abcam公司；山羊抗鼠和山羊抗兔多克隆抗体，购自中杉金桥公司。

1.2 仪器

CO2恒温培养箱，购自Heal Force广州安邦生物公司；全自动细胞计数仪，购自美国 Nexcelom 公司；离心机，购自美国SIGMA公司；全波长酶标仪，购自美国Thermo Fisher Scientific公司；倒置显微镜，购自德国徕卡LEICA公司。

1.3 细胞来源

鼠源H9C2心肌细胞，购于中国科学院上海细胞库。

1.4 H9C2心肌细胞培养

制备含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM细胞完全培养液，于-80 ℃取出H9C2细胞冻存管，立即放入37 ℃水浴，当心肌细胞完全融化后，加入DMEM细胞完全培养液，4 ℃，1 000 r·min-1，离心5 min后，弃去细胞液，加入DMEM细胞完全培养液，轻轻吹打底部细胞悬浮后，接种至75 mm2细胞瓶，37.5 ℃，5% CO2恒温培养2～3 d。倒置显微镜观察细胞生长情况，当平铺细胞量为90%以上，进行细胞传代，完全弃掉细胞液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次，加入5 mL 0.25%的胰蛋白酶，37.5 ℃消化2 min，轻拍细胞瓶，促使细胞消化完全，加入10 mL含胎牛血清的细胞培养液终止消化，接种于新的细胞培养瓶培养。

1.5 配制不同体积分数的DMSO和DMF培养液

分别取10、20、30、50、70、90、100、200、300 μL的DMSO和DMF分别加入10 mL的DMEM高糖完全细胞培养液中，配比为0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%体积分数的DMSO与DMF细胞培养液，经0.22 μm·L-1的微孔滤膜过滤除菌后分别加入75 mm2细胞培养瓶培养。

1.6 细胞毒性试验(MTT法)

将处于对数增长期的H9C2细胞制备为细胞悬液，以1×105mL-1的细胞密度接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h后，加入不同体积分数的DMSO和DMF，每孔重复5个平行试验，共设置7列试验组(加入含不同体积分数的DMSO和DMF)，2列对照组(细胞加培养液)，1列空白组(无细胞，只加细胞培养液)，围绕试验组、对照组、空白组外圈每孔加入100 μL无菌PBS，置于5% CO2的37.5 ℃恒温培养箱培养。避光使用无菌PBS配制5 mg·mL-1的MTT溶液，经0.22 μm·L-1的微孔滤膜过滤除菌，试验组、对照组和空白组每孔加入20 μL，在含5% CO2的37.5 ℃恒温培养箱培养4 h后，彻底吸弃除无菌PBS孔的液体后，每孔加入150 μL DMSO，轻轻吹打几下，低速振荡10 min，置于酶联免疫检测仪中，设置吸收波长为450 nm，测定D值。6个96孔板重复相同操作，分别于24、48、72 h各取出一个96孔板，每个浓度实验结果重复5次，取平均值计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验组D均值-空白组D均值)/(对照组D均值-空白组D均值)×100。

1.7 Western blot检测STAT3和Bcl-2蛋白表达

将H9C2细胞接种在75 mm2细胞瓶中，加入15 mL含有10% FBS和1%双抗的DMEM，置于含5% CO2的37.5 ℃恒温培养箱中。根据细胞毒性试验(MTT法)结果，选取DMSO和DMF体积分数为0、0.2%、0.3%和0.5%加入75 mm2细胞培养瓶中，培养72 h后，取出细胞瓶放于冰盒上，每75 mm2中加入1 mL细胞裂解液，置于含5% CO2的37.5 ℃恒温培养箱中孵育3 min，加入含10% FBS终止消化，在方形冰盒上使用细胞刮充分刮下贴壁的细胞，吸取细胞裂解液加入无菌1.5 mL EP管中，放于冰盒上。收集蛋白完毕后，平衡EP管后放于离心机，12 000 r·min-1离心10 min，取上清加入无菌1.5 mL EP管中，按照5-1样品体积加5×蛋白上样缓冲液，沸水浴7 min，取出样品放于-80 ℃保存。检测目的蛋白STAT3和Bcl-2，先进行SDS-PAGE凝胶电泳，再半干转膜，TBS洗涤3次，10 min一次，5% BSA封闭1 h，4 ℃分别孵育STAT3抗体和Bcl-2抗体(5% BSA分别稀释抗体，比例均为1∶1 000)过夜，TBST充分洗涤3次，每次10 min，加入含辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(稀释比1∶2 500)室温振荡1 h，TBST或TBS洗3次，每次10 min，将含目的蛋白的NC膜放入显影仪，滴加显影液(按照体积比1∶1配比)显影，拍照记录，以β-actin作为内参，使用Image J图像分析软件分析。

1.8 统计方法

采用SPSS 19.0进行统计学分析，以P<0.05和P<0.01分别作为差异显著性和差异极显著性判定标准。

2 结果与分析

2.1 细胞形态变化

观察加入0.3% DMSO和DMF培养心肌细胞24 h后形态变化，细胞生长较为缓慢，部分出现凋亡，形态短缩、不规则，细胞悬浮等变化。随着时间的延长，在48 h和72 h细胞贴壁数量减少，空泡、悬浮细胞量增加。

A和a为对照组(不含DMSO和DMF)；B、C、D分别为0.3% DMSO对H9C2心肌细胞作用24、48、72 h的细胞形态图(5×和10×显微镜)；b、c、d分别为0.3% DMF对H9C2心肌细胞作用24、48、72 h的细胞形态图(5×和10×显微镜)。A and a were control group (without DMSO and DMF); B， C， D， 0.3% DMSO on H9C2 cardiomyocytes for 24， 48， 72 h cell morphology map (5 × and 10 × microscope); b， c， d， 0.3% DMF on H9C2 cardiomyocytes for 24， 48， 72 h cell morphology map (5× and 10× microscope).图1 0.3% DMSO和DMF对H9C2心肌细胞形态变化影响Fig.1 Effects of 0.3% DMSO and DMF on morphological changes of H9C2 cardiomyocytes

2.2 MTT法检测细胞存活率变化

H9C2心肌细胞在DMSO和DMF不同体积分数作用下，通过MTT分别检测24、48和72 h细胞存活率变化(表1和表2)，在DMSO和DMF体积分数为0.3%时，72 h对比48 h细胞存活率具有统计学意义(P<0.05)，并随着DMSO体积分数的增加，细胞存活率逐渐下降。

2.3 Western法测定DMSO和DMF不同体积分数对STAT3蛋白表达的影响

检测DMSO和DMF作用H9C2心肌细胞72 h后，STAT3和Bcl-2的蛋白表达变化。如图3所示，与对照组比较，DMSO和DMF体积分数为0.3%和0.5%时，STAT3和Bcl-2蛋白的相对灰度值都具有统计学意义(P<0.01)，但DMF体积分数为0.2%，STAT3有统计学意义(P<0.01)，Bcl-2无统计学意义；DMSO体积分数为0.2%时，STAT3和Bcl-2与对照组比较均无统计学意义(P>0.05)。

表1MTT法检测DMSO对心肌细胞存活率的影响

Table1Effect of DMSO on myocardial cell survival rate by MTT assay

DMSO体积分数Volume fractionof DMSO/%24 hD值D value存活率Survival rate/%48 hD值D value存活率Survival rate/%72 hD值D value存活率Survival rate/%00.618±0.010100.00±0.000.617±0.003100.00±0.3400.629±0.006100.00±0.5030.10.617±0.01099.56±1.530.604±0.01098.82±1.620.584±0.00997.91±1.050.20.601±0.05098.70±1.210.594±0.02198.28±1.200.573±0.01297.42±1.520.30.598±0.01195.76±1.50∗0.576±0.00891.30±0.23∗a0.538±0.00387.61±0.45∗b0.50.587±0.01792.93±1.68∗0.545±0.00686.33±0.81∗a0.505±0.01080.29±1.09∗b0.70.558±0.02590.22±1.21∗0.520±0.00684.28±0.47∗a0.477±0.00775.81±1.16∗b0.90.543±0.01385.21±1.54∗0.517±0.00478.20±0.69∗a0.454±0.00471.27±0.58∗b1.00.521±0.01079.44±0.078∗0.503±0.00770.47±1.14∗a0.426±0.00465.83±0.68∗b2.00.453±0.01172.24±1.61∗0.431±0.00464.75±0.68∗a0.398±0.00755.32±0.99∗b3.10.377±0.00861.00±1.30∗0.355±0.00954.52±0.38∗a0.309±0.00649.24±1.07∗b

*，与对照组(不含DMSO)相比差异显著，P<0.05；a，与24 h组相比差异显著，P<0.05；b，与48 h组相比差异显著，P<0.05。下同。

*， The significance compared with the control group (without DMSO)，P<0.05; a， The significance compared with the 24 h group，P<0.05; b， The significance compared with the 48 h group，P<0.05. The same as below.

表2MTT法检测DMF对心肌细胞存活率的影响

Table2Effect of DMF on myocardial cell survival rate by MTT assay

DMF体积分数Volume fractionof DMF/%24 hD值D value存活率Survival rate/%48 hD值D value存活率Survival rate/%72 hD值D value存活率Survival rate/%00.601±0.034100.00±0.000.597±0.013100.00±0.000.612±0.034100.00±0.000.10.599±0.02198.72±1.450.583±1.1498.45±1.120.579±1.3498.23±1.560.20.576±0.12098.11±1.320.557±0.24597.91±1.350.521±1.1397.34±0.780.30.546±0.23097.01±0.34∗0.510±0.06794.47±0.67∗a0.498±0.14592.02±0.21∗b0.50.532±0.07896.13±0.63∗0.496±0.34785.03±1.47∗a0.475±0.08380.79±0.44∗b0.70.512±0.13294.65±0.56∗0.479±0.08981.46±0.68∗a0.456±0.05874.54±0.43∗b0.90.491±0.89184.45±0.64∗0.453±0.07878.09±0.34∗a0.424±0.08165.03±0.33∗b1.00.458±0.03180.67±1.12∗0.421±0.00874.54±0.39∗a0.398±0.00663.43±0.51∗b2.00.401±0.06270.34±0.43∗0.379±0.05760.57±0.64∗a0.356±0.01752.54±0.60∗b3.00.345±0.07865.78±0.31∗0.358±0.09755.76±1.06∗a0.321±0.01349.01±0.52∗b

A、B，不同DMSO与DMF体积分数下STAT3和Bcl-2的Western blot结果图；C、D、E、F分别为不同DMSO与DMF体积分数下STAT3和Bcl-2的相对灰度值；**表示与对照组对比差异显著(P<0.01)。A， B， The Western blot results of STAT3 and Bcl-2 with different volume fraction of DMSO and DMF; C， D， E， F were the relative gray values of STAT3 and Bcl-2 with different volume fraction of DMSO and DMF；**， the significance compared with the control group (P<0.01).图2 STAT3和Bcl-2相对表达量的变化Fig.2 Changes of relative expression of STAT3 and Bcl-2

3 讨论

DMSO和DMF常被用作生物研究中的溶剂和药物治疗的载体，可与多种有机和无机物质完全混合，应用于治疗疾病和科学试验研究中，对不同细胞的毒性作用不可被忽略。有研究报道，DMSO对血液系统、兔视网膜上皮细胞等具有毒性作用，高浓度影响外周血单个核细胞(PBMCs)增殖和细胞因子分泌，在低浓度下降低T淋巴细胞的活性，抑制细胞的生长和细胞因子的分泌[7-11]，但体外试验DMSO为0.1%～0.8%时作用大鼠心肌细胞6 h，对细胞活力无影响，抗氧化损伤作用机制与OH-1表达上调有关[12]，推测DMSO对心肌细胞损伤具有治疗作用，体内试验却验证DMSO对脑死亡的大鼠心肌细胞无治疗作用，脑死亡(BD)所致大鼠心肌细胞凋亡作用机制与JNK信号通路的激活通过线粒体通路介导相关，线粒体凋亡通路受Bcl-2、caspase-3、Bax、Cyt-c蛋白影响[13]。DMF对消化系统、泌尿系统、心血管系统、生殖系统等具有损伤作用，主要通过皮肤和呼吸道感染。体外试验DMSO对心肌细胞产生炎性损伤作用，受活性氧和NF-κB调控[14]。本研究发现，DMSO和DMF对H9C2心肌细胞具有不同程度的毒性作用，抑制细胞生长，随着体积分数增加，细胞存活率逐渐降低，Bcl-2和STAT3蛋白表达均有下调，但当DMSO和DMF体积分数增加至0.5%时，STAT3表达上调，推测与机体平衡自身稳态相关，提示Bcl-2与STAT3蛋白可能共同调控DMSO和DMF对心肌细胞的凋亡机制。

Bcl-2家族分为抗凋亡和促凋亡蛋白。抗凋亡蛋白Bcl-2在线粒体介导的凋亡中起着重要的调节作用，通过表达上调，抵抗细胞凋亡损伤，癌细胞常常依赖Bcl-2来保护自己不受凋亡的影响。众所周知，Bcl-2蛋白的分布是一个决定细胞命运的动态过程。Bcl-2存在于线粒体、平滑的内质网(ER)、高尔基体、过氧化物酶体和细胞核中。Bcl-2主要定位于线粒体外膜，可抑制程序性细胞死亡，通过控制线粒体外膜通透性(MOMP)，在线粒体中保留细胞色素C，抵抗细胞凋亡损伤[15]。Bcl-2蛋白的过度表达可以抑制Bax和Bak的激活，阻止细胞色素C的释放和caspase的激活共同改变细胞凋亡[16]。Bcl-2可抑制程序性细胞死亡，细胞淋巴瘤-2(bcl-2)家族的蛋白决定细胞的生命和线粒体自杀程序的凋亡，在程序性细胞死亡中，线粒体凋亡可能是最常见的形式，主要是去除多余的、感染的或受损的细胞[17]。线粒体是心肌细胞主要的能量供应，DMSO和DMF作用心肌细胞产生凋亡，检测抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，心肌细胞线粒体发生凋亡，细胞出现程序性死亡。

信号转导和转录激活因子3(STAT3)在多种细胞和组织中表达，是调节细胞增殖、凋亡和自噬等重要细胞过程的转录因子[18]。STAT3在几种实体癌和血液病中的一个或两个残基中被组成性磷酸化，活化的STAT3从细胞质转移到细胞核，与特定的启动子序列结合，然后调节抗凋亡和细胞周期，调控基因产物(如Bcl-2、XIAP和cyclinD1)的转录激活，发挥抗凋亡作用[19-20]。DMSO和DMF可能通过降低心肌细胞STAT3发生磷酸化，抑制Bcl-2蛋白表达，使细胞存活率下降。