转基因水稻蛋白试纸条与P C R定性检测技术比较研究①

刘倩琪

(广东省深圳市农业科技促进中心 广东深圳 518054)

转基因作物检测是农业安全监管的基础，目前国内外检测转基因生物及其产品最常用的方法有PCR核酸定性、定量法，该方法需要专业技术人员采用专用仪器设备进行检测，检测周期较长、检测成本较高。试纸条法是一种简便、快速的检测方法，专业技术人员经过简单培训即可进行现场检测。但鉴于目前转基因作物种类和品系日渐增多，筛选基因、外源基因、外源蛋白等日趋增加，蛋白检测试纸条的品牌、型号等也越来越多，因此，明确2种方法的准确性、特异性、灵敏度，比较2种检测方法的优劣，确定各自的适用范围具有重要意义。

1 研究内容

采用不同品牌试纸条检测商业化转基因水稻，比较各品牌试纸条的准确性、特异性、灵敏度。

采用PCR定性检测法检测转基因水稻、标记基因及品系特异性序列，确定PCR法的局限性、准确性、灵敏度。

分析蛋白检测试纸条法与PCR定性检测法检测结果的相关性；比较不同试纸条的优缺点，及其各自的适用范围。

2 研究材料

转基因水稻汕优63(TT51-1)品系4个浓度(5%、1%、0.5%、0%)样品，由上海交通大学提供。

转基因水稻科丰6号(KF6)、Ⅱ优科丰6号(Ⅱ优KF6)、克螟稻(KMD)、M12品系1%粉末，由农业农村部科技发展中心提供。

3 研究方法

按照转基因水稻品系、检测参数、外源蛋白等不同分别设计试验方案，并确定每个品系采用的核酸检测方法和试纸条类型。

3.1 PCR定性检测法

采用农业农村部颁布的转基因植物及其产品成分检测相关检测标准，对转基因水稻不同品系各个参数进行检测。

3.2 蛋白试纸条检测法

本次试验购买了8个品牌试的转基因蛋白检测的试纸条，其中，国内品牌5个，分别是上海佑隆、中科院油料所、武汉上成、浙江拓普、广州金标；进口品牌3个，分别是Agdia(美国)、Envirologix(美国)、Artron(加拿大)。检测的蛋白涵盖了常见的抗虫、抗除草剂蛋白[1]。

4 结果与分析

4.1 PCR定性检测法检测不同转基因水稻的准确性、特异性、灵敏度

采用KF6(1%)、Ⅱ优KF6号(1%)、KMD(1%)、M12(1%)、TT51-1(浓 度 5%、1%、0.5%、0%)5个品系的阳性标准品，依据农业农村部颁布的一系列转基因成分检测标准为依据，采用PCR定性检测法检测了4个筛选基因(CaMV35S、NOS、NPTⅡ、HPT)、1个 Bt目 的 基 因、3个 品 系(KMD、M12、TT51-1)特异性序列。结果(表1)显示，各转基因阳性标准品可以通过4个筛选基因(CaMV35S、NOS、NPTⅡ、HPT)及 1个 Bt目 的基因进行初步筛选检测，每个品系检测结果与此前所搜集到的各项转基因水稻品系核酸检测参数信息一致，根据筛选基因的检测结果进行特异性更高的品系特异性检测，3个品系(KMD、M12、TT51-1)特异性序列的检测结果均为阳性。KF6、Ⅱ优KF6号因缺乏相应的检测标准，而未能检测。

此次试验同时还检测了TT51-1的 4个浓度梯 度 (5%、1%、0.5%、0%)， 其 中 NOS、Bt、TT51-1均能检测到0.5%浓度。

4.2 不同试纸条检测商业化转基因水稻的准确性、特异性、灵敏度

采用 KF6(1%)、Ⅱ优 KF6(1%)、KMD(1%)、M12(1%)、TT51-1(浓度5%、1%、0.5%、0%)5个品系的阳性标准品，用8个品牌的Cry1Ab/Cry1Ac试纸条进行检测。结果(表2)显示，8个品牌的试纸条均能检测出5%浓度的TT51-1。除了广州金标试纸条仅能检测出5%浓度TT51-1，其余所有样品的检测结果均为阴性。武汉上成、浙江拓普、上海佑隆和Envirologix 4个品牌的试纸条检测1%KF6、1%Ⅱ优KF6、1% KMD、TT51-1(5%、1%、0.5%)结果均为阳性。油料所、Agdia、Artron 3个品牌的试纸条均能检测出1% KF6、1% Ⅱ优KF6、1%KMD、1% M12、5% TT51-1，但无法检测出0.5%TT51-1。各品牌试纸条检测M12结果均为阴性，即M12含有抗除草剂EPSPE蛋白，但不含有抗虫Cry1Ab/Cry1Ac蛋白。同时，8个品牌的试纸条均无法鉴定转基因水稻品系[2]。

表1 水稻PCR检测结果

表2 不同品牌试纸条检测转基因水稻结果比较

5 结论

5.1 PCR核酸定性检测法与试纸条检测法的局限性比较

目前，检测水稻中转基因成分的商业化试纸条只有Bt-Cry1Ab/1Ac免疫诊断试纸条，其他抗病毒、品质改良的转基因水稻品系都无法检测。已知的9个转基因水稻品系中只有4个品系含有Cry1类抗虫蛋白，也就是说，现有的试纸条只能检测转Cry1类抗虫蛋白的品系[3]。PCR定性检测法可以检测水稻中CaMV35S、NOS、Bt、hpt、SCK等参数，在已知的9个转基因水稻品系中至少含有CaMV35S、NOS、Bt、hpt中的一个参数，漏检概率远远小于试纸条检测法。

5.2 PCR核酸定性检测法与试纸条检测法的准确性比较

由于现有商业化试纸条只能检测Cry1类抗虫蛋白，具体是Cry1Ab、Cry1Ac，还是Cry1Ab/1Ac，需要多张试纸条才能检测，且无法判断品系。此外，试纸条检测需要提取样品中的粗蛋白，现场检测存在粉碎样品、沉淀或离心、清洗等条件的局限，一般存在取样量较少、样品代表性不够等问题，而国产试纸条的灵敏度只有1%，因此存在漏检(即假阴性)的风险。PCR定性检测法可直接检测转基因水稻中的外源基因片段，对于有争议的阳性结果还可以采用酶切、测序等方法辅助判断，因此，准确性远远高于试纸条检测法。

5.3 PCR核酸定性检测法与试纸条检测法的灵敏性比较

目前仅GB/T 19495.8—2004规定了转基因植物蛋白检测方法，主要针对抗虫基因Cry1Ab/1Ac试纸条法。该标准规定试纸条法主要检测转基因棉花中的Cry1Ab/1Ac蛋白，同时也适用于其他含有Cry1Ab/1Ac蛋白的转基因植物，但检测灵敏度必须保证在0.25%以上。而现有国产转基因Cry1Ab/1Ac快速测试纸条的灵敏度为1%，进口试纸条检测灵敏度大于0.1%。根据资料以及本单位做过的若干次核酸定性试验的数据显示，一般PCR定性检测的灵敏度能达到0.1%；若以基体阳性样品为材料，最高的灵敏度能达到0.05%；若以DNA阳性样品为材料，最高的灵敏度能达到0.01%。