何首乌九蒸九晒炮制工艺研究

2019-09-24路丽张洪坤林钦贤黄玉瑶吴韶辉潘林燕高贯彪

安徽农业科学 2019年15期

路丽张洪坤林钦贤黄玉瑶吴韶辉潘林燕高贯彪

摘要[目的]阐明何首乌传统炮制工艺九蒸九晒过程中多成分含量变化的科学内涵。[方法]采用传统的黑豆共蒸法进行九蒸九晒，并首次监测炮制过程中多成分的含量变化。[结果]随着何首乌蒸晒次数的增加，浸出物、二苯乙烯苷含量呈明显的下降趋势，游离蒽醌含量则显著上升;多成分含量测定中，没食子酸呈现先上升后下降，儿茶素、二苯乙烯苷含量逐渐减少，大黄素、大黄素甲醚呈缓慢上升趋势，5-羟甲基糠醛含量变化不明显。[结论]何首乌九蒸九晒过程中性状及各成分含量变化规律明显，可为何首乌的炮制提供理论依据和工艺参考。

关键词何首乌;九蒸九晒;炮制工艺;多成分含量;变化规律

中图分类号 R282文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）15-0177-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.049

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract[Objective]The research aimed to clarify the scientific connotation of the change of multicomponent content in the processing technology of ninetime repeat of the steaming and sundrying （NRSSP） of Polygonum multiflorum.[Methods]To steam with black beans and NRSSP，and for the first time monitoring the change of multicomponent content during processing.[Results]With the increase of steaming times of Polygonum multiflorum，the contents of alcohol soluble extract and stilbene glycoside showed a significant downward trend，the content of free anthraquinones increased significantly;in the determination of multicomponent content，gallic acid first increased and then decreased，the content of catechin and stilbene glucoside decreased gradually，the content of emodin and physcion slowly increased，the change of the content of 5hydroxymethylfurfural was not obvious.[Conclusion]The rules of characteristics and contents of the main components in the processing technology of NRSSP of Polygonum multiflorum are obvious，it can provide a theoretical basis and process reference for the processing.

Key words Polygonum multiflorum;Ninetime repeat of the steaming and sundrying;Processing technology;Multicomponent content;Variation law

基金项目国家中医药管理局中药标准化项目（ZYBZH-Y-AH-03）。

作者简介路丽（1990—），女，安徽滁州人，药师，硕士，从事中药研发及质量评价研究。*通信作者，主管药师，硕士，从事中药研发及其质量评价研究。

收稿日期 2019-03-11

何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）为蓼科植物何首乌的干燥块根。经黑豆汁炮制后的何首乌具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂等功效，可用于血虚萎黄、眩晕耳鸣、须发早白、腰膝酸软、肢体麻木、崩漏带下、高脂血等症[1]，含有主要成分包括二苯乙烯类、蒽醌类化合物、磷脂类，另含鞣质、五味子素、没食子酸、儿茶素、游离的必需氨基酸类化合物及丰富的微量元素等[2-3]。

历史上何首乌的炮制方法較多[4]，不少中医古籍[5-7]提倡九蒸九晒，因此法太过繁琐且生产效率很低，能源和人力消耗大，并且一般认为炮制时间太长会使得炮制品质量下降，故如今多数饮片企业已不采用，为了适应时代要求，新工艺、新技术被不断引入现代炮制研究中[8-10]。为改进何首乌传统炮制方法，致使其古今炮制方法不尽相同，经典九蒸九晒法并没有被严格地传承下来，2015版《中国药典》制何首乌项下并未明确规定炮制次数，为探究九蒸九晒法是否科学合理有必要，其科学内涵急需诠释。因此，笔者采用HPLC法测定不同蒸晒次数炮制何首乌时各主要药效成分含量，旨在探明炮制过程中各成分含量变化规律，为客观诠释何首乌传统炮制工艺九蒸九晒的科学内涵提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent-1200型高效液相色谱仪;RHP-100型高速多功能粉碎机（浙江永康市荣浩工贸有限公司）;XS204型电子天平（d=0.1 mg，Mettler Toledo）;HWS-26型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）;DHG-9245A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试材甲醇（批号170721，天津市四友精细化学品有限公司，色谱纯）;乙腈（批号170511，天津市四友精细化学品有限公司，色谱纯）;磷酸（批号161226，天津基准化学试剂厂，分析纯）。二苯乙烯苷对照品（2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，批号110844-201512）、大黄素对照品（批号110756-201512/110756-200110）、大黄素甲醚对照品（批号110758-201013）、没食子酸（批号110831-201204）、5-羟甲基糠醛（批号111626-201610）、儿茶素（批号110877-201604），中国食品药品检定研究院。何首乌生药（产地四川，批号1708244332）、黑豆（产地安徽，批号1708184251），均由亳州市沪谯饮品厂提供;生品何首乌经广州香雪制药股份有限公司连林生高级工程师鉴定为蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥块根。

1.3 方法

1.3.1 炮制方法。取何首乌约3 kg，称重，取1/10留样拍照，剩余样品备用，取270 g黑豆，加水浸泡过夜，第2天取黑豆汁与何首乌样品混匀，闷润至黑豆汁吸尽。转移至蒸笼中，铺一层何首乌，再铺一层泡软的黑豆，层层铺尽，常压隔水蒸制6 h，放入55 ℃烘箱中干燥至6成干。留取蒸出液，取240 g黑豆与之混合，浸泡过夜，取1/9留样，剩余样品与前一晚浸泡的黑豆汁混匀，闷润至黑豆汁吸尽。转移至蒸笼中，铺一层何首乌，再铺一层泡软的黑豆，层层铺尽，常压隔水蒸制5 h，放入55 ℃烘箱中干燥至6成干。留取蒸出液，取210 g黑豆与之混合，浸泡过夜。如此进行反复9次的蒸制，每次分别留样，用于含量测定。炮制品性状描述见表1。

1.3.2 浸出物含量测定。按照醇溶性浸出物测定法（2015版《中国药典》四部通则2201）项下的热浸法测定，用乙醇作为溶剂，计算供试品中醇溶性浸出物含量。

1.3.3 二苯乙烯苷含量测定。

1.3.3.1 色谱条件与系统适用性试验。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-水（25∶75）为流动相;检测波长为320 nm。

1.3.3.2 对照品溶液的制备。取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1 mL含0.225 7 mg的溶液，即得。

1.3.3.3 供试品溶液的制备。取本品粉末（过四号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，上清液滤过，取续滤液，即得。

1.3.3.4 线性关系的考察。分别精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积（X）为横坐标、进样量（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。

1.3.3.5 精密度试验。取经2次蒸晒的制首乌供试品溶液，精密吸取10 μL，按“1.3.3.1”色谱条件，重复进样6次，记录二苯乙烯苷峰面积的RSD。

1.3.3.6 稳定性试验。取经2次蒸晒的制首乌供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h间隔进样10 μL，记录二苯乙烯苷峰面积的RSD。

1.3.3.7 重复性试验。取经2次蒸晒的制首乌粉，按“1.3.3.3”供试品溶液的制备方法共制备6份供试品溶液，进行含量测定，计算二苯乙烯苷含量的RSD。

1.3.3.8 加样回收率试验。精密称取已知含量的何首乌粉末（过四号筛）0.1 g，平行6份，分别加入等量二苯乙烯苷对照品适量，混匀，按“1.3.3.3”制备二苯乙烯苷供试品溶液的方法處理，进行含量分析，计算加样回收率。

1.3.3.9 样品测定。分别称取何首乌生品及九蒸九晒后的样品，按“1.3.3.3”方法制备供试品溶液，每个样品平行3次，进样测定，以均值作为结果，计算样品中二苯乙烯苷的含量。

1.3.4 蒽醌类含量测定。

1.3.4.1 色谱条件与系统适用性试验。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）为流动相;检测波长为254 nm。

1.3.4.2 对照品溶液的制备。取大黄素对照品、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL含大黄素81.328 8 μg、大黄素甲醚32.802 2 μg的溶液，即得。

1.3.4.3 供试品溶液的制备。取本品粉末（过四号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液5 mL作为供试品溶液A（测游离蔥醌用）。另精密量取续滤液25 mL，置具塞锥形瓶中，水浴蒸干，精密加8%盐酸溶液20 mL，超声处理（功率100 W，频率40 kHz）5 min，加三氯甲烷20 mL，水浴中加热回流1 h，取出，立即冷却，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷液，酸液再用三氯甲烷振摇提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液B（测总蒽醌用）。

1.3.4.4 线性关系的考察。分别精密吸取大黄素、大黄素甲醚对照品溶液2、4、6、8、10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积（X）为横坐标、进样量（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。

1.3.4.5 精密度试验。取经2次蒸晒的制首乌供试品溶液，精密吸取10 μL，按“1.3.4.1”色谱条件，重复进样6次，分别记录游离蒽醌及总蒽醌测定时大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD。

1.3.4.6 稳定性试验。取经2次蒸晒的制首乌供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h间隔进样10 μL，分别记录游离蒽醌及总蒽醌测定时大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD。

1.3.4.7 重复性试验。取经2次蒸晒的制首乌粉，按“1.3.4.3”的方法制备供试品溶液，进行含量测定，分别记录游离蒽醌及总蒽醌测定时大黄素、大黄素甲醚含量的RSD。

47卷15期路丽等何首乌九蒸九晒炮制工艺研究

1.3.4.8 加样回收率试验。精密称取已知含量的何首乌粉末（过四号筛）0.5 g，平行6份，分别加入等量大黄素、大黄素甲醚对照品适量，混匀，按“1.3.4.3”游离蒽醌供试品溶液的方法处理，进行含量分析，计算加样回收率。

1.3.4.9 样品测定。分别称取何首乌生品及九蒸九晒后的样品，按“1.3.4.3”方法制备供试品溶液，每个样品平行3次，进样测定，以均值作为结果，计算样品中蒽醌类成分的含量。

1.3.5 多成分含量测定。

1.3.5.1 色谱条件与系统适用性试验。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇为流动相A，以0.5%醋酸溶液为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱;流速1.0 mL/min;检测波长280 nm;柱温35 ℃，进样量10 μL。

1.3.5.2 对照品溶液的制备。取没食子酸、5-羟甲基糠醛、儿茶素、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每1 mL含没食子酸14.02 μg、5-羟甲基糠醛26.18 μg、儿茶素17.85 μg、二苯乙烯苷333.60 μg、大黄素32.60 μg、大黄素甲醚75.24 μg的混合溶液，即得。

1.3.5.3 供试品溶液的制备。取何首乌和制何首乌粉末（四号筛）各约0.5 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液30 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

1.3.5.4 线性关系的考察。分别精密吸取混合对照品溶液2、6、8、10、15 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以各待测物进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归。

1.3.5.5 精密度试验。取经2次蒸晒的制首乌供试品溶液，精密吸取10 μL，按“1.3.5.1”色谱条件，重复进样6次，分别记录各成分峰面积的RSD。

1.3.5.6 稳定性试验。取经2次蒸晒的制首乌供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h间隔进样10 μL，分别记录各成分峰面积的RSD。

1.3.5.7 重复性试验。取经2次蒸晒的制首乌粉，按“1.3.5.3”的方法制备供试品溶液，进行含量测定，分别记录各成分峰面积，计算各成分含量的RSD。

1.3.5.8 加样回收率试验。精密称取已知含量的何首乌粉末（过四号筛）0.25 g，平行6份，按制何首乌中各成分含有量分别加入相应量的没食子酸、5-羟甲基糠醛、儿茶素、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚，混匀，按“1.3.5.3”供试品溶液的制备方法处理，进行含量分析，计算加样回收率。

1.3.5.9 样品测定。分别称取何首乌生品及九蒸九晒后的样品，按“1.3.5.3”方法制备供试品溶液，每个样品平行3次，进样测定，以均值作为结果，计算样品中没食子酸、5-羟甲基糠醛、儿茶素、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚的含量。

2 结果与分析

2.1 二苯乙烯苷含量测定的方法学考察

2.1.1 对照品与样品的高效液相色谱峰图。从图1可以看出，在相同的色谱条件下，样品在对照品相同出峰时间中均有相应的一个峰出现，且该条件下样品中的目标峰与相鄰峰的分离度较大，空白无干扰，说明此条件适合测定二苯乙烯苷的含量。

2.1.2 线性关系的考察。以峰面积（X）为横坐标、进样量（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得出二苯乙烯苷回归方程为Y=0.020 0X+0.085 2（R2=0.999 7），表明二苯乙烯苷在0.451 4～2.257 0 μg线性关系良好。

2.1.3 精密度试验。按照“1.3.3.5”方法操作，结果发现二苯乙烯苷峰面积的RSD为0.6%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验。按照“1.3.3.6”方法操作，结果发现二苯乙烯苷峰面积的RSD为0.8%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.1.5 重复性试验。按照“1.3.3.7”方法操作，结果发现二苯乙烯苷含量的RSD为1.3%，表明该方法重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验。按照“1.3.3.8”方法操作，结果发现二苯乙烯苷平均加样回收率为103.5%，RSD=0.6%，表明该方法回收率较好，方法可行。

2.2 蒽醌类含量测定的方法学考察

2.2.1 对照品与样品的高效液相色谱峰图。从图2可以看出，在相同的色谱条件下，样品在对照品相同出峰时间中均有相应的峰出现，且该条件下样品中的目标峰与相邻峰的分离度较大，空白无干扰，说明此条件适合测定大黄素、大黄素甲醚的含量。

2.2.2 线性关系的考察。以峰面积（X）为横坐标、进样量（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得出大黄素回归方程为Y=0016 1X+0.001 4（R2=1.000 0），大黄素甲醚回归方程为Y=0.020 3X+0.000 1（R2=1.000 0），表明大黄素、大黄素甲醚分别在0.162 7～0.813 3、0.065 6～0.328 0 μg线性关系良好。

2.2.3 精密度试验。按照“1.3.4.5”方法操作，分别记录游离蒽醌及总蒽醌测定时大黄素、大黄素甲醚峰面积，结果发现大黄素的RSD分别为0.2%、0.2%，大黄素甲醚的RSD分别为0.3%、0.4%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 穩定性试验。按照“1.3.4.6”方法操作，分别记录游离蒽醌及总蒽醌测定时大黄素、大黄素甲醚峰面积，结果发现大黄素RSD分别为0.2%、0.7%，大黄素甲醚RSD分别为0.2%、0.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.5 重复性试验。按照“1.3.4.7”方法操作，分别记录游离蒽醌及总蒽醌测定时大黄素、大黄素甲醚峰面积，结果发现大黄素RSD分别为1.1%、1.2%，大黄素甲醚RSD分别为1.3%、0.9%，表明该方法重复性良好。

2.2.6 加样回收率试验。按照“1.3.4.8”方法操作，计算加样回收率，结果发现大黄素和大黄素甲醚的平均加样回收率分别为97.5%、101.1%，RSD分别为1.1%、1.3%，表明该方法回收率较好，方法可行。

2.3 多成分含量测定的方法学考察

2.3.1 对照品与样品的高效液相色谱峰图。从图3可以看出，在相同的色谱条件下，样品在对照品相同出峰时间中均有相应的峰出现，且该条件下样品中的目标峰与相邻峰的分离度较大，空白无干扰，说明此条件适合测定各成分的含量。

2.3.2 线性关系的考察。以各待测物进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，具体结果见表3，结果表明，各成分在相应的范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验。按照“1.3.5.5”方法操作，结果得出制何首乌中没食子酸、5-羟甲基糠醛、儿茶素、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.4%、0.6%、1.1%、0.2%、0.3%、0.1%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验。按照“1.3.5.6”方法操作，结果得出制何首乌中没食子酸、5-羟甲基糠醛、儿茶素、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.6%、0.5%、1.5%、0.3%、0.4%、0.6%，表明供试品溶液在8 h内测定，峰面积基本稳定。

2.3.5 重复性试验。按照“1.3.5.7”方法操作，结果得出制何首乌中没食子酸、5-羟甲基糠醛、儿茶素、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚的含量平均值分别为0.196 8、0.004 7、0.159 5、9.339 7、0.888 3、1.046 9 mg/g，RSD分别为1.0%、1.9%、1.0%、1.6%、2.0%、1.3%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验。按照“1.3.5.8”方法操作，计算加样回收率，结果得出制何首乌6种成分没食子酸、5-羟甲基糠醛、儿茶素、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚的平均加样回收率分别为100.1%、98.8%、97.0%、100.2%、102.1%、979%，RSD分别为1.4%、0.4%、0.9%、1.3%、1.0%、0.8%，表明该方法回收率较好，方法可行。

2.4 各指标含量测定结果各成分的方法确定并验证后，取不同炮制品何首乌样品，进行各指标含量测定，结果见表4。

结果表明，随着何首乌蒸晒次数的增加，其外观性状及多成分指标均产生较大影响，其中性状表现为表面及断面颜色逐渐加深，质地也变得坚硬;浸出物、二苯乙烯苷含量呈明显的下降趋势，其中九蒸九晒后二苯乙烯苷含量与生品相较，下降达58.5%，可能原因为二苯乙烯苷具有热不稳定性，随炮制时间的延长和温度的升高而降低。游离蒽醌的含量则随着蒸晒次数的增加而持续上升，较生品升高达307.9%，文献也表明，九蒸九晒过程中大黄素和大黄素甲醚含量的增加可能与结合蒽醌的水解有关[11]。相反，结合蒽醌的含量持续下降，九蒸九晒时含量达到最低，总蒽醌含量总体缓慢上升，八蒸八晒后达最大值。多成分含量测定中，何首乌黑豆汁蒸制法中随着蒸制时间的延长，没食子酸含量先上升后下降，六蒸六晒时达到最高值，总体含量上升;5-羟甲基糠醛含量较低，变化不明显;儿茶素则是持续下降;二苯乙烯苷含量减少，在一次蒸晒时达到最高点后持续下降，总体规律与药典法测得结果相近;大黄素、大黄素甲醚随着蒸晒次数的增加含量基本呈缓慢上升趋势。

3 讨论与结论

生品何首乌有一定副作用，使用不当可对人体造成损害，经过炮制的何首乌降低或消除了对人体的副作用，并能增强滋补功能，而近年来何首乌导致不良反应问题时有发生[12-13]，其毒性物质基础尚不明确，对何首乌肝毒性成分的报道多以蒽醌类、芪类及鞣质类成分为主，其中以结合蒽醌在肝毒性作用中占主导地位[14-15]。何首乌作为典型的生熟异治中药，临床功效安全发挥很大程度上取决于炮制工艺的规范性与可靠性，经九蒸九晒后其外形、功效、成分均发生了极其复杂的变化，既有已知成分量的变化，同时存在内在成分质的改变，炮制监测过程中发现，何首乌除游离蒽醌含量增加以外，二苯乙烯苷及结合蒽醌类成分含量均呈下降趋势，该过程物质成分的变化与其减毒机制、临床药效发挥是否相关联，是何首乌质量安全性评控的难点和重点问题。同时，古法炮制中的九蒸九晒是否仅代表炮制时间长短，而非确切的蒸晒次数，仍有待考证。

饮片质量是中药炮制过程及整个产业链的核心，炮制规范是保证中药有效性、安全性的基础，对于经临床应用具有一定疗效的传统炮制工艺，为避免失传，应当基于现代多学科知识、技术手段，从化学成分、药理作用、毒副作用及临床药效等方面进行深入研究后，批判性继承发扬。而传统炮制工艺九蒸九晒与现代炮制工艺因加工设备、技术参数不同而产生新的化学成分及其与功效改变的关系，值得进一步深入研究。

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