不同品系小麦分蘖期TaSPL17基因表达分析

沈文俊 赵吉强

摘要[目的]探究9个品系小麦分蘖相关基因TaSPL17基因表达与单株分蘖力强弱的关系。[方法]通过实时荧光定量PCR技术，从基因表达水平角度，分析9个品系小麦分蘖期茎基部组织TaSPL17基因相對表达量与不同品系小麦分蘖力强弱的关系。[结果]不同品系小麦分蘖期茎基部组织TaSPL17基因表达存在显著差异，单株分蘖力较强的多穗型品系烟农19、瑞丰1号、Bonito-32，TaSPL17基因表达处于相对较低水平;分蘖力中等的中大穗型品系济麦22、石优17、衡06-6632、济宁936098，TaSPL17基因表达处于相对中等水平;分蘖数较少的大穗型品系兰考906、泰山021，TaSPL17基因表达处于相对较高水平，TaSPL17基因对小麦单株分蘖力具有调控作用。[结论]为研究小麦分蘖力强弱能力提供了基因表达水平上的理论依据，为选育理想株型提供了理论基础。

关键词 小麦;分蘖;TaSPL17;理想株型

中图分类号 S188文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）15-0101-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.028

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract[Objective]To explore the relationship between the expression of TaSPL17 gene related to wheat tillering in 9 wheat lines and the tiller ability of individual plants.[Method]From the perspective of gene expression， the relationship between the relative expression of TaSPL17 gene in the stem of 9 wheat lines at the tillering stage and the tillering ability of different lines wheat lines were analyzed by the quantitative realtime PCR.[Result]There were significant differences in the expression of TaSPL17 gene in the stem of different wheat lines at tillering stage. TaSPL17 gene expression level was relatively low in multispike lines with strong tillering ability， such as Yannong 19， Ruifeng 1 and Bonito32; the TaSPL17 gene expression was at a relatively moderate level in mediumlarge spike lines with medium tillering ability， such as Jimai 22， Shiyou 17， Heng 06-6632 and Jining 936098;TaSPL17 gene expression was relatively high in large spike lines with few tillering ability， such as Lankao 906 and Taishan 021， TaSPL17 gene had regulation effect on tillering ability of wheat.[Conclusion]The results provide a theoretical basis for the gene expression of tiller ability and the breeding of ideotype.

Key words Wheat;Tiller;TaSPL17;Ideotype

作者简介 沈文俊（1993—），女，山东潍坊人，硕士研究生，研究方向：植物分子发育生物学。*通信作者，副教授，博士，从事植物分子发育生物学研究。

收稿日期 2019-05-06

小麦（Triticum aestivum L.）作为世界上最重要的粮食作物之一，为全球超过1/3的人口提供主要食粮。提升粮食产量是育种工作者的主要目标，同时挖掘粮食产量潜力也是我国小麦品种改良的长期任务。随着分子生物学的发展，挖掘和利用提升产量的基因资源，将会为高产、高抗小麦新品种的培育提供科学的资源保障。小麦在完成植物生活史的过程中会经历种子萌发、营养生长、生殖生长和衰老凋亡等一系列的发育阶段，每个阶段都表现出独有的形态学和生理学上的特征。从拔节期到孕穗期，小麦经历了从营养生长到生殖生长的转变。茎尖分生组织由产生新叶转变为产生幼穗。从穗的形成、花的发育再到开花，各个发育阶段都会影响籽粒的最终产量[1]。

小麦从营养生长到生殖生长的各个阶段都会有新的植物器官形成，这些器官发育程度、形成时期、过渡时机都会对小麦的最终产量造成较大的影响。例如，花从营养生长到开花的正确时机对于确保结实成功至关重要，一个小的开花时间延迟会导致生物量和产量增加，过早开花则会导致生物量和种子量减少[2]。植物株型同样是决定产量的主要因素之一。株型包括植株的高度，茎秆的粗壮程度，分蘖力的强弱，叶片的宽度、厚度以及夹角等。农作物产量与农作物单株形态建成有着必然的联系，植物理想株型应具备茎秆粗壮抗倒伏，分蘖数、叶片宽厚及夹角合理，耐受生物胁迫和非生物胁迫的能力等要素。随着农作物分子育种的快速发展，育种工作者有望在小麦中实现理想株型的概念。

SPL（SQUAMOSA-promoter binding proteinlike）基因是编码植物蛋白的一类转录因子，在基因结合位点处富含GTAC序列，该序列是SBP结构域的核心基序，具高度保守性，SBP-box转录因子在调控植物营养生长和生殖生长阶段转变、花器官和果实发育、光信号转导及植株形态建成等诸多发育阶段中起到至关重要的作用[3]。迄今为止仅在高等绿色植物中发现此类家族基因，最初从金鱼草花序cDNA文库中筛选得到，因其具有SQUAMOSA启动子结合活性且能够结合花器官分生组织决定基因而命名。SPL家族基因是调控植物株型的重要基因，近年来在模式植物拟南芥中发现17个SPL家族基因，农作物水稻中发现19个SPL家族基因以及小麦中发现58个SPL家族基因[4-6]。对这些植物SPL家族基因的研究发现，它们大多数都具有miR156/157识别位点，其转录翻译受到miR156/157的调控，参与了植物生长发育的各个阶段，包括在植物形态建成与器官发育的整个过程中，例如在植物根系生长、植物叶片发育、植物分蘖形成、植物花器官发育和果实成熟、生物胁迫与非生物胁迫的应答以及植物激素信号转导等多个方面都发挥了重要的作用[7]。

在农作物形态建成方面，分蘖是水稻、小麦等主要禾本科植物的重要农学性状，小麦产量的构成因素包括单位面积上小麦穗数、穗粒数以及千粒重3个重要因素，分蘖力的强弱又与农作物成穗率直接相关，从而间接地影响农作物单位面积的产量[1]。分蘖不仅受到植物激素的调控，而且受到分蘖相关基因的调控。在水稻理想株型研究中，SPL家族基因在其形态建成中的作用至关重要，例如OsSPL8在叶耳的发育方面起作用;OsSPL14具有减少分蘖、增加产量的作用;OsSPL16具有减少分蘖，控制籽粒大小、形状的作用等。后续研究发现，将水稻OsSPL14基因过量表达会使植株分蘖数降低、茎秆粗壮抗倒伏，增加植株产量[8-10]。通过进一步研究发现IPA1基因可以直接绑定到水稻控分蘖基因OsTB1的启动子上，激活OsTB1的表达，抑制水稻分蘖芽的生长，减少植株分蘖数[11]。结合水稻研究成果，在小麦中克隆得到OsIPA1/OsSPL14的直系同源基因TaIPA1/TaSPL17，研究发现TaSPL17基因在小麦穗部和茎基部表达量较高[12-13]，表明TaSPL17基因可能与小麦的分蘖有关，并且可能会使小麦增产[14]。笔者通过对9个品系小麦分蘖期茎基部组织材料分蘖相关基因TaSPL17基因相对表达量进行分析，结合不同品系小麦单株分蘖力强弱，探究不同品系小麦分蘖相关基因TaSPL17基因表达与单株分蘖力强弱的关系，为选育理想株型提供分子生物学理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选用单株分蘖力较强的多穗型品系烟农19、瑞丰1号、Bonito-32，分蘖力中等的中大穗型品系济麦22、石优17、衡06-6632、济宁936098，以及分蘖数较少的大穗型品系兰考906、泰山021。高纯度种子由烟台市农业科学研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取。在小麦分蘖期分别取得9个品系小麦茎基部组织材料，采用艾德莱生物（Aidlab）公司生产的EASY spin植物RNA快速提取试剂盒，按照说明书中步骤提取小麦材料的总RNA，并对提取的RNA进行质量检测。

1.2.2 反转录。取1 μg左右的总RNA，将提取的9种样品采用两步法进行反转录，获得cDNA。反转录反应体系及程序为：第一步（10.0 μL体系：总RNA 1.0 μg，Oligo dT 1.0 μL，RNase Free ddH2O补齐至10.0 μL;程序：72 ℃，30 min，放置于冰上保存），第二步（20.0 μL体系：第一步产物10.0 μL，5×Buffer 4.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，RNA Inhibitor 0.2 μL，M-MLV 1.0 μL，RNase Free ddH2O补齐至20.0 μL;程序：42 ℃，90 min;70 ℃，15 min）。反应结束后将cDNA稀释20倍后于-20 ℃保存，作为荧光定量PCR的模板。

1.2.3 实时荧光定量PCR。通过对实时荧光定量PCR引物进行优化，设计并筛选出TaIPA1基因定量分析引物，使用德国生产的Rotor Gene Q仪器及Vazyme公司生产的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，检测TaSPL17基因相对表达量，分析小麦分蘖相关基因TaSPL17的表达结果，结合不同品系小麦分蘖力的强弱，探究两者之间的关系。

1.3 数据分析

定量结果、熔解曲线分析用Rotor-Gene Q series software完成。利用Excel 2016软件作图、作表及误差处理。

2 结果与分析

2.1 不同品系小麦分蘖期茎基部总RNA提取

将9个品系的小麦分蘖期茎基部组织材料使用RNA快速提取试剂盒提取总RNA。经超微量分光光度计检测RNA样品浓度和纯度，结果显示：所有样品A260/A280的比值均在1.988～2021，A260/A230的比值均在2.038～2.324，浓度值均在1 780～2 760 ng/μL，说明所提取的RNA均浓度高、纯度好、无杂质或小分子物质污染。将RNA样品在1%琼脂糖凝胶电泳中进行检测，样品均呈现出比较清晰的18S和28S这2条主带（图1），表明所提取的样品RNA具有较好的完整性，样品质量较高，可以用于反转录反应。

2.2 不同品系小麦分蘖期TaSPL17基因相对表达量分析

以提取的9个品系小麦分蘖期茎基部总RNA反转录成的cDNA为模板，对实时荧光定量PCR引物进行优化，设计并筛选出TaIPA1基因定量分析引物，選择TaGAPDH和TaeEF作为内标基因（表1），经PCR验证后得出3对引物共同的最佳退火温度为60 ℃。使用Vazyme公司生产的含有SYBR Green I染料的荧光定量试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，反应程序设定为预变性95 ℃ 3 min;变性95 ℃ 10 s，退火60 ℃30 s，延伸72 ℃30 s进行40个循环。每个样品都做重复对照，反应结束后对所有样品的熔解曲线（图2）进行分析，确保基因特异性扩增，并采用双内参计算法计算TaSPL17基因相对表达量（图3）。从熔解曲线可以看出，利用不同内参引物及目标基因引物进行PCR扩增时，扩增产物均为单峰，说明基因实现特异性扩增，且不同引物的熔解温度之间存在差异。使用双内参法计算基因相对表达量可进一步对试验数据进行校正，减小试验误差。

從定量分析作图结果来看，不同品系小麦分蘖期分蘖相关基因TaSPL17基因表达存在明显差异，所选材料瑞丰1号、烟农19和Bonito-32品系小麦分蘖期茎基部组织TaSPL17基因相对表达量处于较低水平;衡06-6632、石优17、济宁936098、济麦22品系小麦分蘖期茎基部组织TaSPL17基因相对表达量处于中等水平;泰山021、兰考906品系小麦分蘖期茎基部组织TaSPL17基因相对表达量处于较高水平。

3 结论与讨论

结合水稻方面的研究成果，与水稻OsIPA1/OsSPL14基因直系同源的小麦TaIPA1/TaSPL17基因可能具有相同的生物学功能，即该基因表达上调会使植株分蘖数降低、茎秆粗壮抗倒伏，增加植株产量。由此，根据所选材料定量分析结果可以看出瑞丰1号、烟农19和Bonito-32品系小麦分蘖期茎基部组织TaSPL17基因相对表达量与其他6个品系相比表达较低，结合这3个品系具有单株分蘖力较强、多穗的特点可以得出TaSPL17基因表达下调会使小麦单株分蘖力增强;衡06-6632、石优17、济宁936098和济麦22品系小麦分蘖期茎基部组织TaSPL17基因相对表达量与其他5个品系相比表达中等，结合这4个品系具有分蘖力中等，穗型中、大的特点可以得出TaSPL17基因表达处于中等水平时，小麦的形态建成有利于提升产量，符合理想株型的概念[15];泰山021、兰考906品系小麦分蘖期茎基部组织TaSPL17基因相对表达量与其他7个品系相比较高，结合这2个品系具有分蘖数较少、穗大的特点可以得出TaSPL17基因表达上调会使小麦单株分蘖力减弱。结合不同品系小麦分蘖能力及穗型等特点可以得出，与水稻理想株型形态建成相关基因水稻OsIPA1/OsSPL14的直系同源基因TaIPA1/TaSPL17在小麦中具有相同的生物学功能，并且结果表明，小麦TaIPA1/TaSPL17基因在不同品系的小麦分蘖期都具有调控分蘖能力的作用，对于分蘖数多少、穗型大小造成不同的影响。由此得知，小麦TaIPA1/TaSPL17基因在小麦单株形态建成及单株产量方面具有重要作用。

通过对小麦分蘖期茎基部组织材料TaSPL17基因定量表达分析，从基因表达水平角度初步探究9个品系小麦分蘖力强弱与分蘖相关基因TaSPL17基因表达之间的关系，为选育理想株型小麦、提升作物产量提供分子生物学理论基础。对于小麦TaSPL17基因拓展研究应用以及在农作物分子育种上应用，有望使农作物提升产量，但是农作物产量不仅受植株形态建成的影响，而且受气候条件、温度条件、土壤条件、种植模式等因素的影响。

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