污泥好氧堆肥中功能菌群的分离筛选

张先成 李晶 曹旭 姜威 胡基华 孟利强

摘要 开展了污泥堆肥中功能菌株筛选的研究，分别以污泥堆肥物料中的各种大分子有机物为目标底物，筛选各自的降解菌株，通过初筛和复筛（酶活性强弱）选择最佳功能菌株，优化组合获得污泥堆肥的功能复合菌群。该研究可为污泥堆肥的功能菌株优选及其工艺优化提供理论依据和技术支持。

关键词 污泥堆肥;功能菌群;分离筛选;酶活

中图分类号 S141.4文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）15-0078-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.022

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract In this study， functional strains in sludge sludge composting were screened. The various organic macromolecules of sludge composting materials were used as the target substrates to screen degradation strains. The best functional strains were obtained by the preliminary screening and secondary screening， then were assembled into a functional bacteria community. This work would provide theoretical basis and technical support for screening functional strains in sewage sludge composting and their process optimization.

Key words Sewage sludge composting;Functional bacteria community;Separation and screening;Enzyme activity

基金项目 国家自然科学青年基金项目（51708187）;黑龙江省科学院科学基金项目（wsw6840228）;黑龙江省科学院杰出青年基金项目（CXJJ2018SW01）。

作者简介 张先成（1984—），男，黑龙江伊春人，高级工程师，硕士，从事微生物学、基因工程研究。*通信作者，副研究员，硕士，从事生物技术、固体废弃物资源化处理等研究。

收稿日期 2019-03-11

市政污水厂的污泥产量增加，污泥带来的环境污染问题日趋严重，所以污泥处理迫在眉睫[1]。目前污泥处理技术主要有干化焚烧、土地填埋、厌氧消化和好氧堆肥，其中好氧堆肥因其易于控制且成本较低，是国内外污泥处理行业的主流技术之一[2-3]。然而，迄今为止污泥堆肥过程中仍然存在着一系列尚未解决的问题，包括调理剂成本控制、重金属污染、堆肥启动缓慢等，尤其北方的冬季由于气温较低，不利于堆肥微生物的生长繁殖，导致堆肥不能迅速启动，这会延长堆肥周期，增加堆肥成本[4]。筛选合适的污泥堆肥功能菌株可以改善堆肥过程，提高堆肥产品的品质。

1 材料与方法

1.1 培养基

各功能菌株（淀粉降解菌、蛋白质降解菌、油脂降解菌和纤维素降解菌）分离培养基配制参照王春铭等[5]的方法。

1.2 方法

1.2.1 模拟堆肥。堆肥模拟试验在堆肥反应器里完成，反应器内径300 mm、高600 mm，每个反应器中均匀混合放入2.0 kg 脱水污泥和1.0 kg 浮石调理剂。采用强制通风供氧，每个反应器通风速率设定为0.4 L/min。

1.2.2 常规微生物数量统计。采用常规平板计数法，称取1 g堆肥样本，加入少量灭菌石英砂及少量无菌水研磨后，定容至100 mL，得到10-2菌悬液，依次稀释得到10-3、10-4和10-5菌悬液。分别吸取100 μL 10-2、10-3、10-4和10-5菌悬液涂布于各种培养基上，分别于各自温度培养，每个稀释度3个重复。

1.2.3 各功能菌的初筛复筛。参照王春铭等[6]的方法。

1.2.4 菌种的活化与接种。筛选出的高温菌种保存于4 ℃冰箱，采用各自的液体培养基活化培养，55 ℃150 r/min，装液量为每个三角瓶 50 mL，摇床培养48 h用于接种污泥堆肥试验。堆肥试验接种量采用1%单个菌株，空白处理采用除去菌体的培养基液体代替，减少系统误差。在堆肥起始阶段接入强化菌群，与堆肥物料混匀开始堆肥试验[7]。

1.2.5 標准方差σ计算公式[8-9]。

σ=1NNi=1（xi-μ）2

式中，x1，x2，…，xN均为试验中测得或计算所得数据（N≥3）;μ为x1，x2，…，xN的平均值。

2 结果与分析

2.1 功能菌株的分离筛选

首先采用各功能菌的分离培养基进行分离筛选，分别获得59株有机质降解菌，12株淀粉降解菌，21株蛋白质降解菌，25株油脂降解菌和17株纤维素降解菌，纯化后编号置斜面保存，部分试验照片如图1。

2.2 污泥有机质降解菌的筛选

对分离纯化出的59株有机质降解菌进行污泥有机质降解试验，以不加菌作为空白对照。污泥有机质去除率大于55%的细菌及污泥有机质去除率大于45%的放线菌列于表1。由表1可知，细菌类降解菌M7、M11，放线菌类降解菌O10 污泥有机质降解率较高，将上述3株菌作斜面保存。

2.3 淀粉降解菌的筛选

对分离纯化出的12株淀粉降解菌进行淀粉水解试验，水解能力大于3的菌株列于表2。综合考虑菌株的水解能力和淀粉酶活性，可知S1的淀粉酶活性是最高的，达1.3×104 U/mL，将该菌株斜面保存备用。

2.4 蛋白质降解菌的筛选

对分离纯化出的21株蛋白质降解菌进行蛋白质水解试验，水解能力大于3的菌株列于表3。综合考虑菌株的水解能力和蛋白质酶活性，可知P2的淀粉酶活性是最高的，达76.3 U/mL，将该菌株斜面保存备用。

2.5 油脂降解菌的筛选

对分离纯化出的25株油脂降解菌进行油脂水解试验，水解能力大于4的菌株列于表4。综合考虑菌株对油脂的水解能力和油脂酶活性，可知O22的油脂酶活性是最高的，达148.0 U/mL，将该菌株斜面保存备用。

2.6 纤维素降解菌的筛选

对分离纯化出的17株纤维素降解菌进行纤维素水解试验，滤纸失重量大于0.3 g 的菌株列于表5。综合考虑菌株对纤维素的水解能力和纤维素酶活性，可知C15的纤维素酶活性是最高的，达51.5 U/mL，将该菌株斜面保存备用。

2.7 筛选结果汇总及鉴定

根据上述筛选结果，通过比对各菌株水解圈大小和酶活性强弱，筛选出理想功能菌株，分别选取酶活性最强的菌株作为优选组合的目标菌株进行复合选育，最终确定有机质降解菌为M7、M11、O10，淀粉分解菌S1，蛋白质分解菌P2，油脂分解菌O22和纤维素分解菌C15。综上，将菌株M7、M11、O10、S1、P2、O22和C15组合成一组混合菌群。对上述7个菌株进行鉴定，采用分子生物学技术测得16S rDNA序列，进行比对分析，完成鉴定。技术路线：菌种基因组DNA提取→16S菌保守序列PCR扩增→3730测序。基因组DNA提取，经过电泳检测确认后，进行PCR扩增，采用细菌通用引物（27f：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT）[10]，根据GeneBank上Blast比对，确认菌属关系如表6。

3 结论

通过在堆肥高温期间取样、分离培养，共分离获得59株有机质降解菌，12株淀粉降解菌，21株蛋白质降解菌，25株油脂降解菌和17株纤维素降解菌。复筛考察水解圈大小、滤纸失重率，再通过测定酶活，筛选出酶活性最高的菌株，确定最优混合菌群由M7、M11、O10、S1、P2、O22和C15组合，经鉴定M7菌株为地衣芽孢杆菌，M11菌株为短小芽孢杆菌，O10菌株为高温放线菌，S1菌株为地衣芽孢杆菌，P2菌株为莫海威芽孢杆菌，O22菌株为短小芽孢杆菌，C15菌株为凝结芽孢杆菌。后续将进一步研究该菌群的应用效果。

参考文献

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[2]李常慧.污泥高温好氧堆肥工艺优化的研究[D].郑州：河南工业大学，2015.

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[6]王春铭，卢建文，雷恒毅，等.城市污泥堆肥过程中微生物研究[J].生态环境，2007，16（2）：462-466.

[7]王守红，徐荣，朱凌宇，等.不同菌种组合对发酵残余物好氧堆肥進程及氮素变化的影响[J].环境工程学报，2017，11（12）：6429-6436.

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[10]MENG L Q，LI W G，ZHANG S M，et al.Effects of sucrose amendment on ammonia assimilation during sewage sludge composting[J].Bioresour Technol，2016，210：160-166.