华东地区宫颈鳞状细胞癌组织HPV感染型别的特征分析

施启丰 崔成军 王昊珏 耿建祥 兰建云 王志蕙 蔡为民 王宏景 赵 雪

(1.无锡市锡山人民医院病理科，江苏 无锡 214011；2.无锡市锡山人民医院皮肤科，江苏 无锡 214011；3.无锡市锡山人民医院妇产科，江苏 无锡 214011；4.南京中医药大学第三附属医院病理科，江苏 南京 210001)

宫颈癌是女性生殖道恶性肿瘤发病率第一位的恶性肿瘤，而其中宫颈鳞状细胞癌约占60%～70%的比例[1-2]。目前的研究显示，宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒(HPV)感染密切相关[3-4]，后者是引起宫颈癌的明确致病因子[5]。因此对于宫颈细胞学检查及宫颈乳头瘤病毒的筛查，已经成为宫颈癌防治的重要策略。我们应用基因扩增芯片技术对705份宫颈鳞状细胞癌组织进行23种HPV分型检测，并对23种HPV型别在宫颈鳞状细胞癌中的感染特征进行探讨，为宫颈鳞状细胞癌的防治提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 本组病例选取2006年1—6月间无锡市锡山人民医院、南京市中医院、徐州市中医院、江苏省扬中市人民医院、常熟市第一人民医院、南京市六合区人民医院、江苏省射阳县人民医院、南京市大厂医院、镇江市第一人民医院、盐城市第一人民医院、镇江市丹徒区人民医院、安徽省当涂县人民医院、山东省临沂市肿瘤医院病理科诊断的705例宫颈鳞状细胞癌患者的石蜡组织标本，所有病理切片均按2014年WHO女性生殖器官肿瘤的组织学诊断标准，经两位主治以上病理医师独立阅片确认。患者20～29岁7例，30～39岁63例，40～49岁258例，50～59岁204例，60～69岁104例，70～79岁56例，80～89岁12例，90岁以上1例。平均年龄(52.45±11.52)岁。

1.2仪器与试剂 HPV基因分型检测试剂盒购自亚能生物技术(深圳)有限公司；基因扩增仪为新加坡生产的Gene Amp PCR system 2400型；分子杂交仪为江苏省兴化市分析仪器厂生产的FYY3型；高速冷冻离心机为德国生产的Eppendorf 5810R型；生物安全柜为江苏省苏州市安泰空气技术有限公司生产的BHC-1300ⅡA2型；青岛海尔有限公司生产的-20 ℃冰箱等。显色液于使用时用蒸馏水新鲜配制。

1.3方法 (1)石蜡组织切片：先去除每例宫颈鳞状细胞癌组织周边的石蜡，将石蜡包埋的组织切成4 μm厚的切片，3～5片即可，用专用的镊子轻轻夹取，放入1.5 mL离心管中。切第2例石蜡组织前，用次氯酸钠溶液擦刀片及镊子各3次。(2)DNA的提取：将150 μL裂解液加入含有石蜡组织片的离心管中，充分振荡混匀，100 ℃金属浴加热10 min，立即13 000 rpm离心10 min，取中间层DNA溶液待用。(3)PCR扩增：PCR反应体系总体积27 μL，上机扩增条件为50 ℃ 15 min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s；42 ℃ 90 s；72 ℃ 30 s，共40个循环，72 ℃ 5 min。(4)杂交、孵育和显色：51 ℃杂交箱内杂交1.5 h，室温孵育30 min，显色至少30 min。终止显色，转移至去离子水中浸泡即可观察结果。

1．4 统计学处理 应用统计软件包SPSS13.0对相关数据进行统计学处理，分类变量资料采用χ2和μ检验进行统计学分析，取单侧，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1结果判定 (1)实验后每张膜条在PC位点必须出现蓝色显示信号；(2)阴性质控品除PC位点出现蓝色显色信号外其余位点均不出现蓝色显色信号；(3)阳性质控品除PC位点出现蓝色显色信号外，必须在相应HPV基因型位点上出现蓝色显色信号；(4)每张膜条上除PC位点外有23种HPV型别(6、11、42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4型)的杂交显色位点，除PC位点显色外，肉眼可观察23种HPV型别位点上呈现蓝色小圆点为阳性信号；(5)出现一个阳性信号为单一型别的感染，出现两个阳性信号为双型别的混合感染，出现两个以上的阳性信号为多型别的混合感染。

2.2HPV总感染情况 705例患者中，66例HPV病毒检测为阴性，阴性率为9.36%(66/705)；639例23种HPV基因分型检测阳性，阳性率为90.64%(639/705)；其中单独HPV型别感染527例，2种HPV感染92例，3种HPV感染15例，4种HPV感染2例，5种、6种及9种HPV感染各1例。HPV型别的分布情况见表1，其中HPV16、18、58、33、52、31型依次为感染阳性率前6的病毒。

表1 639例HPV分型检测阳性分布表

2.3HPV型别感染情况 在本组病例中，HPV感染型别占比5%以上的型别分别为16、18及58型。HPV16单独或合并其他HPV感染462例，占全部病例数的65.53%(462/705)，其中单一型别HPV16型感染376例，占HPV16感染数的81.39%(376/462)；HPV18病毒单独或合并其他型别感染86例，占全部病例的12.20%(86/705)，其中HPV18病毒单一型别感染36例，占HPV18感染数的41.86%(36/86)；HPV58型单独或合并其他HPV感染51例，占全部病例数的7.2%(51/705)，其中单独HPV58型感染25例，占HPV58型总感染数的49.01%(25/51)。

2.4HPV型别和发病年龄相关情况 HPV阴性组发病年龄(56.22±11.19)岁与总HPV感染后发病年龄(52.67±11.50)岁相比，差异无显著性(P>0.05)。与HPV阴性组发病年龄相比，HPV16感染后发病组年龄为(50.18±10.31)岁，差异有显著性(μ=4.14，P<0.001)；同样HPV18感染组年龄为(51.19±9.62)岁， 差异有显著性(μ=2.92，P<0.05)；HPV58型感染组年龄为(64.29±13.25)岁，差异有显著性(μ=3.49，P<0.001)；而HPV33型、31型、52型感染组发病年龄与HPV阴性组差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

在我国宫颈癌是女性发病率仅次于乳腺癌的常见恶性肿瘤。研究明确，宫颈癌的发生与生殖道的HPV病毒感染密切相关。HPV感染除了能够引起机体多种形式的损伤外，病毒DNA还能够与宫颈上皮细胞DNA进行整合，导致宿主宫颈上皮细胞的异常增殖[6]，进而发展为宫颈不典型增生、甚至癌变。

目前发现的HPV类型有200多种，主要分为皮肤型和生殖道黏膜型，根据致病性，HPV又可划分为高危和低危两类，其中低危型包括HPV6、11、42、43、44等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变；高危型一般包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别。也有学者把HPV73、82归入高危型，目前尚缺乏统一共识，但HPV16和18型与宫颈上皮内高度病变、宫颈癌及其他恶性肿瘤发生有明确相关性，这一点已在全球得到广泛认同[7-8]。

有研究显示，检测方法的不同会影响到宫颈癌HPV病毒的检出率，而采用本文所用的基因扩增法，检出率能够达到90.64%，可以为宫颈癌的防控及疫苗的改进提供可靠的循证医学证据。本组资料结果显示除HPV16、18型外，HPV58型检出率也高于5%，提示应将HPV58列入该地区的HPV病毒检测类型，以确保阳性检出率；同时在HPV病毒疫苗的研发过程中，需要充分分析不同亚型HPV病毒感染率的地区性差异，才能开发出更适合国人的疫苗[10]。本资料中不同HPV病毒亚型和感染后发病年龄的相关性结果提示，对HPV16、18、58型病毒感染的患者需要加强随访，以便能更好地达到防治宫颈癌的效果[11]。

本资料中我们对一组江苏及山东部分地区的妇女宫颈鳞状细胞癌病例标本进行了HPV病毒检测，结果发现：(1)本组705例患者中，23种HPV基因分型检测阳性者为639例，阳性率达90.64%，且以HPV16、18及58型感染为主，与国内学者对不同地域、不同高危型别的研究结论一致[12-13]。我国江苏及山东部分地区HPV58型感染率显著高于国外，可见WHO建议各地区建立宫颈癌组织 HPV感染的基因分型数据库是十分重要的[14]。我们发现HPV31、33、52型 为仅次于前三型的高危病毒，与其他学者报道[15]的相关数据有所差异，不同的检测方法及患者年龄、地域等因素或许是其顺序不同的原因。排位靠后的三型病毒感染人数偏少且有合并感染，故我们认为此排列顺序对临床意义较小。(2)单种病毒感染更易诱发宫颈鳞状细胞癌，而以多种病毒感染为辅，这与国内学者[16]对于浙江地区HPV感染患者宫颈鳞状细胞癌以单病毒感染为主的研究结果一致。值得注意的是，多位国外学者[17-18]发现多种感染所致的肿瘤发病率明显增高，而这一点在国内的研究中并未得到证实，我们推测：特定型别的病毒搭配所致的多重感染或许可影响肿瘤发展的进程，而也有学者[19]认为病毒间的相互拮抗导致多重感染的癌病率降低，其确切原因仍需进一步研究证实。(3)感染率排前6位的HPV病毒为HPV16、18、58、33、52、31型，其中超过5%感染例数的病毒为HPV16、18、58型。(4)与病毒检测结果为阴性的患者相比，HPV16、18型病毒感染者的发病年龄明显高于阴性组及其他各型病毒感染组，而HPV58型为我国较为特殊的致病型别，但目前其发病年龄并未受到重视，HPV58型感染者似乎有更长的肿瘤进展期，进一步探究其导致延迟发病的机制，这对于我国HPV感染及相关疾病的防治具有重要意义。