两种HBV DNA定量检测方法的临床对比研究

王爽 郭杰 王大刚 时景仁 潘美晨 殷商启 何超男 孟欢 张响 王雅杰

在目前全球面临的最严峻的公共卫生问题中，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是最大的问题之一，目前全球慢性感染者逾2.57 亿人，每年死亡88.7 万人，其中约25%死于肝癌或肝脏相关并发症［1］。最大限度地长期抑制HBV 复制是慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）患者的治疗目标之一［2］。HBV DNA 定量检测主要用于判断慢性HBV 感染的病毒复制水平，HBV DNA复制水平越高，传染性就越强［3］。HBV DNA 是反映HBV 复制的最直接、最可靠的指标，在评价乙型肝炎药物的疗效与预后判定等方面具有至关重要的作用［4］。

荧光定量PCR 技术检测HBV DNA 具有灵敏度高特异性好的特点［5］。目前国产的HBV DNA荧光定量PCR 试剂种类很多，各类试剂之间的性能参数如灵敏度、特异性、线性范围等方面存有差异［6-7］。临床检测使用国产试剂，开展HBV 血浆病毒载量检测，相较于采用进口试剂不但能及时监测患者疗效，又能降低患者经济负担。本研究采用某国产超敏HBV 病毒核酸定量检测试剂盒（简称国产试剂）和目前国际上普遍认可的某进口试剂（简称进口试剂）这2 种试剂盒对乙型肝炎患者血浆中的病毒载量进行平行检测，通过对2 种检测结果的相关性和一致性进行对比分析，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2019年2月至6月在首都医科大学附属北京地坛医院就诊的本院门诊及住院乙型肝炎患者的血浆514 例，所有患者诊断标准符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》。选择的患者均为单一HBV 感染，排除其他肝炎病毒或原因引起的肝病，同时选择无黄疽、溶血和脂血的样本。所有患者均已签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

进口HBV 定量检测系统采用COBAS AmpliPrep 提取仪，标本用量为600 μL；扩增试剂为COBAS HBV Test，v2.0（瑞士，Roche）。国产HBV定量检测系统采用Smart 32 全自动核酸提取仪（磁珠法），标本用量为200 μL；扩增试剂采用超敏PCR 扩增试剂（购自国产中山大学达安基因股份有限公司），检测仪器采用美国ABI 7500 型荧光定量PCR 仪。

1.3 方法

将514 例血浆标本分别用进口和国产试剂，按照试剂盒说明书标准步骤进行平行检测。2 种HBV 核酸检测方法的基本原理一致，均通过荧光定量PCR 技术进行乙肝病人血浆中HBV 病毒载量的检测。2 种检测试剂的特征比较详见表1说明。

1.4 统计学方法

用Excel 对数据进行整理，对有数值的HBV DNA 病毒载量数据进行对数转换（log10），通过SPSS 16.0 软件进行统计学分析。采用配对t检验分析不同方法检测结果的差异，用相关分析法分析不同试剂检测结果的相关性，采用Bland-Altman模型分析不同检测方法检测结果的一致性，试剂比对用线性分析和χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 种试剂检测结果比较

本研究共收集慢乙肝患者血浆514 例。进口试剂结果检测的数值分布为：“未检测到HBV”的标本117 例，＜20 IU/mL 的标本110 例，20～＞1.7×108IU/mL 区间的标本287 例（其中＞1.7×108IU/mL的标本33 例）。将国产试剂测试的结果与进口结果进行比对分析（见表2），结果显示：进口试剂的阳性检出率为77.2%（397/514），国产试剂的阳性检出率为78.5%（404/514），说明2 种试剂的阳性检出率较接近，没有明显的差异（P＞0.05）；两种试剂间的不符合率（一种检测结果高于检测下限/另一种检测结果低于检测下限）分别为：进口试剂7.2%（37/514）和国产试剂8.6%（44/514），没有显著差异（P＞0.05）。进口与国产试剂检测结果为“未检测到HBV”和＜20 IU/mL 完全一致的标本分别为73 例和54 例，2 种试剂同时高于检测下限的样本为285 例（55.4%）。

表1 2 种试剂的特征比较Table 1 Characterization comparison of 2 reagents

2.2 国产和进口试剂检测结果的相关性和一致性分析

将国产试剂和进口试剂检测结果中285 例大于检测下限的病毒载量值，其中33 例＞1.7×108IU/mL（取对数为＞8.23）的标本，这33 例标本的达安试剂检测结果值为（8.55±0.39），说明检测结果一致。对检测结果在20～1.7×108IU/mL 区间内的252 例载量值取对数后进行相关性和一致性分析（图1）。两种试剂检测结果的相关系数r=0.966（P＜0.000 1），表明二者具有较强的相关性（图1A）；Bland-Altman 分析两种方法检测病毒载量的差异分析显示，国产与进口试剂定量值差值平均值为0.173log10IU/mL，95%可信区间为（-0.677 9～1.024 0）log10IU/mL。95.6%（241/252）的样本检测值在95%可信区间内，说明国产与进口试剂具有高度一致性（图1B）。

表2 2 种试剂检测结果比较Table 2 Comparison of the results of 2 reagents

图1 2 种试剂检测的相关性和一致性分析Figure 1 The Correlation and consistency analysis between 2 reagents

本组结果按照不同病毒载量区间（低中高）进行相关性分析，国产试剂与进口试剂结果各组的相关性均良好；不同病毒载量区间范围内的相关性没有明显的差别，说明国产高敏试剂与进口试剂间在对不同病毒载量病人HBV DNA 的检测能力上是一致的（如表3所示）。其中，在低浓度区20～103IU/mL 也具有良好的相关性，说明试剂的检测灵敏度较好。

3 讨论

HBV DNA 定量检测已经广泛应用于临床，为慢性乙型肝炎患者的诊疗和预后判断提供重要的参考依据［8-10］。结合传统HBV 血清标志物结果，对临床判定传染性和指导治疗具有重要的参考价值［11-13］。目前进口试剂具有明显的高特异性和高灵敏度，同时其准确性和重复性也被业界公认为是HBV DNA 定量检测的“金标准”［14］。进口试剂具有精密度好、灵敏度高的特点，但是其试剂和仪器成本较高，检测花费时间长，需要患者提供的血浆量大，在临床上难于普及，特别是中小型医院。同时试剂本身价格的昂贵又制约了一部分乙肝病人进行乙肝定量定期检测的需求。基于诸多因素，开发国产试剂，使之进一步改善国产试剂检测灵敏度、特异性、重复性等特点具有十足的意义。

表3 2 种试剂有效值在不同病毒载量区间相关性分析结果Table 3 Relativity analysis of 2 reagents in different virus load intervals

在本次比对实验中，国产试剂与进口试剂2 种方法的检测结果可能会因实验方法、实验原理、检测靶点等各种差异引起检测数值上差异［15-16］。从方法学比较可以看出，本实验的两种方法均采用自动化磁珠提取法获取病人血浆中的HBV DNA，首先从模板获取效率上是一致的；在扩增试剂上，达安高敏试剂不仅提高了线性范围至109IU/mL，在灵敏度上也将检测下限降至10 IU/mL，可以给出更宽的检测范围，包括0～20 IU/mL之间的数值。本次研究平行检测了514 例慢乙肝病人血浆标本，从进口试剂和国产试剂检测结果比较发现，两者的阳性检出率基本一致，没有明显差异；同时，两者的不符合率也比较接近。对两种试剂检测结果的有效值进行分析可以得出较好的相关性和一致性，特别在低拷贝区（20～103IU/mL）相关性也较好，说明国产试剂与进口试剂的检测效率是一致的。

国产试剂提高了检测灵敏度，甚至在载量为0～10 IU/mL 的结果也能够给出数值，但由于其低于试剂盒的灵敏度，只能判断样本为阳性，其定值结果也仅供参考。对比结果显示，进口试剂检测结果为“未检测到HBV”的标本在国产试剂中测出为＞20 IU/mL 的结果有4 例，测出＜20 IU/mL 的结果有40 例，还不能确定这部分结果是由于试剂灵敏度差异产生的结果，也不排除这44 例为假阳性结果，可能存在实验过程中污染等问题，需要第三方试剂的验证，但是目前还缺乏权威性的试剂来对这种低水平载量的检测验证。进口试剂检测结果＜20 IU/mL 在达安基因试剂结果为“未检出HBV DNA”的样本有36 例；进口试剂结果＜20 IU/mL 的标本用国产试剂检测＞20 IU/mL 的共20 例，反之的结果有1 例，这部分结果说明在检测下限附近还存在数据检测结果的差异，不排除检测过程中的人为误差或系统本身的误差造成的这一区域的结果差异，但由于这部分国产试剂的检测结果处于20～100 IU/mL 范围之间，排除其他指标变化的情况对于临床来说这种差异不会造成明显的治疗方案上的改变［2］。

乙肝病毒标记物的检测可为我国乙肝患者进行早期预防和治疗提供重要的判定依据，具有重要的应用价值［17］。现临床常用试剂检测方法还有待提高，尽管进口试剂具有开放性，检测准确、精密度高等优势，但因科室发展需要和经济水平受限等原因，目前使用国产试剂的临床单位较为普遍。目前国产试剂也在努力开发更加高灵敏度、高特异性的试剂缩短与进口试剂之间的差距从而满足临床需求，这有助于提高临床对乙型肝炎的早期诊断，也有利于国家卫生事业的蓬勃发展。在本次实验中，国产试剂在低拷贝区与进口试剂的检测差异在逐渐减少，也体现出了国产试剂在操作时长的控制和人为误差的控制上的提高，这极大的提高了临床检验的效率，降低了人为操作误差所带来的误判。由于本文病例的选择并非完全随机，还需要通过大样本、多中心的数据来验证确切的结论。