仙人掌多酚超声辅助醇提工艺优化及抗氧化、降脂能力分析

王 婧 郭 阳 包怡红 田 雪 李 欢 邱隽蒙

(东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

米邦塔仙人掌是一种原产于墨西哥的食用性仙人掌，中国农业部优质产品开发中心自1998年引进米邦塔仙人掌以来，在国内进行了引种及推广，目前作为一种新型保健蔬菜已逐步进入消费者的餐桌[1]。高翔等[2-4]的研究显示，米邦塔仙人掌中含有丰富的营养成分，包括矿物质、蛋白质、纤维素及多种维生素，同时富含镁、锰、铜、锌等微量元素，是一种营养丰富的优质蔬菜。季慧等[5]研究表明，米邦塔仙人掌中含有多种活性功能成分，如多糖、多酚、黄酮、超氧化物歧化酶(SOD)、生物碱类化合物和有机酸类等。已有徐丛玥等[6-8]、朱凯等[9]分别研究了米邦塔仙人掌中的多糖和黄酮。

植物多酚又称植物单宁。研究[10]表明：植物多酚具有抗氧化、抑菌消炎、抗病毒、抗癌等多种生物学功能，因此植物多酚作为天然抗氧化剂及食品功能成分，一直是研究的热点。然而已有的文献对米邦塔仙人掌中多酚的研究较少，Andreu等[11]曾对西班牙地中海仙人掌枝叶和果实的总酚含量及理化性质进行分析，但未对其生理活性如体外降脂功能进行测定。试验以米邦塔仙人掌为原料，拟采取超声波辅助法制备多酚提取物，以多酚含量及DPPH自由基清除力为指标，通过正交试验优化最佳工艺条件，并对其抗氧化活性及其降血脂能力进行评价，为米邦塔仙人掌的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

米邦塔仙人掌：产于江苏宿迁；

胃蛋白酶(30 000 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠：生化试剂，北京博奥拓达有限公司；

无水乙醇、没食子酸、抗坏血酸、1, 1-二苯-2-苦基肼、水杨酸、邻苯三酚、水杨酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

电子天平：YP2002型，上海佑科仪器仪表有限公司；

高速万能粉碎机：PW-100型，天津泰斯特仪器有限公司；

数控超声波清洗器：KQ-300DE型，300 W，昆明市超声仪器有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9240型，上海一恒科技有限公司；

台式离心机：TGL-16G型，上海安亭科学仪器厂；

可见分光光度计：722型，上海光谱仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：TU-1810型，北京善析通用仪器有限公司；

旋转蒸发器：RE-52A型，上海亚荣生化仪器厂；

三孔电热恒温水槽：DK-8D型，上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料处理 取新鲜米邦塔仙人掌，去皮，切块(1 cm×1 cm×1 cm)，60 ℃恒温干燥至恒重，粉碎过60目筛，备用。

1.2.2 多酚含量测定 采用紫外分光光度法。配制质量浓度分别为1，5，10，15，20，25 μg/mL的没食子酸标准液，在190～400 nm波长下进行光谱扫描，重复操作3次，测定266 nm波长处的吸光值绘制标准曲线。在0～25 μg/mL 浓度范围内线性回归方程为：Y=0.047 7x-0.002 9，R2=0.999 7。将上清液稀释20倍，测定其吸光度并计算多酚含量，重复3次[12-13]。

1.2.3 DPPH自由基清除率测定 根据文献[14]的方法进行测定，按式(1)计算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

Q——清除率，%；

A0——2 mL无水乙醇加2 mL DPPH溶液的吸光度值；

A1——2 mL待测液加2 mL DPPH溶液的吸光度值；

A2——2 mL待测液加2 mL无水乙醇的吸光度值。

1.2.4 提取工艺单因素试验设计

(1) 乙醇浓度对多酚提取率及DPPH自由基清除能力的影响：在料液比1∶20(g/mL)，乙醇浓度(体积分数)分别为50%，60%，70%，80%，90%，温度50 ℃条件下超声50 min，将提取液在4 000 r/min下离心20 min，取上清液测定其多酚含量及DPPH自由基清除能力。

(2) 超声温度对多酚提取率及DPPH自由基清除能力的影响：料液比1∶20(g/mL)，乙醇浓度70%，分别在30，40，50，60，70 ℃条件下超声50 min，将提取液在4 000 r/min 下离心20 min，取上清液测其多酚含量及DPPH自由基清除能力。

(3) 超声时间对多酚提取率及DPPH清除能力的影响：在料液比1∶20(g/mL)，乙醇浓度70%，温度50 ℃条件下分别超声20，30，40，50，60 min，将提取液在4 000 r/min 下离心20 min，取上清液测其多酚含量及DPPH自由基清除能力。

(4) 料液比对多酚提取率及DPPH清除能力的影响：分别以1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25(g/mL)的料液比，在乙醇浓度70%，温度50 ℃条件下超声50 min，将提取液在4 000 r/min下离心20 min，取上清液测其多酚含量及DPPH自由基清除能力。

1.2.5 正交试验优化 选取乙醇浓度、超声温度、超声时间、料液比为考察因素，每个因素选取3个水平，以综合评分为指标，用L9(34)正交表进行试验。

1.2.6 综合评分 以多酚含量和DPPH自由基清除率为双指标，将所得数据进行归一化处理、统一数量级，利用综合评分值对试验结果进行评价[15-16]。代入式(2)计算各指标综合评分Yij′。

(2)

式中：

Yij′——综合评分；

Yij——第j列的指标数据值，%；

Yjmin——第j列中指标最小值，0；

Yjmax——第j列中指标最大值，100。

对两个指标进行加权分配，设定多酚含量和DPPH自由基清除率的权重系数分别为0.5，0.5，即多酚含量和DPPH自由基清除率的加权值Wj分别为W1=0.5，W2=0.5，将Y1、Y2代入式(2)得到Y1′、Y2′即加权综合评分值Y=0.5Y1′+0.5Y2′。

1.2.7 米邦塔仙人掌多酚提取物抗氧化性 将仙人掌粉按照最佳提取工艺条件提取得到上清液，再将上清液经旋蒸浓缩后干燥得到样品，配制不同浓度的样液进行试验，以抗坏血酸为对照。

(1) 对羟基自由基的清除能力：根据文献[17]的方法进行测定。

(2) 对超氧阴离子自由基的清除能力：根据文献[18]的方法进行测定。

1.2.8 米邦塔仙人掌多酚提取物降血脂能力 将仙人掌粉按照最佳提取工艺条件提取得到上清液，再将上清液旋蒸浓缩后干燥得到样品，配制不同浓度的样液进行试验。

(1) 体外胆固醇吸附能力测定：参照文献[19]的方法修改如下，取新鲜鸡蛋的蛋黄，加入9倍量的蒸馏水，搅打成乳液。分别取10 g稀释蛋黄液于两个200 mL的三角瓶中，并加入0.5 g样品，调节pH至2.0和7.0，37 ℃下恒温振荡2 h，4 000 r/min离心20 min，吸取0.04 mL上清液，在波长550 nm条件下比色测定胆固醇含量。代入式(3)计算胆固醇的吸附量。

(3)

式中：

X——吸附量，mg/g；

A1——吸附前蛋黄胆固醇量，mg/g；

A2——吸附后蛋黄胆固醇量，mg/g；

m——样品质量，g。

(2) 体外胆酸盐吸附能力测定：参照文献[20]的方法修改如下，分别取3 mL不同浓度的样液于100 mL三角瓶中，加入0.01 mol/L的HCl溶液1 mL，10 mg/mL胃蛋白酶(以pH 6.3的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制) 3 mL，37 ℃下恒温振荡消化1 h，模拟胃环境；以0.1 mol/L的NaOH调节pH至6.3，加入10 mg/mL胰蛋白酶(以pH 6.3 的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制) 4 mL，37 ℃下恒温振荡消化1 h，模拟肠道环境。分别加入4 mL 0.4 mmol/L甘氨胆酸钠及4 mL 0.5 mmol/L牛磺胆酸钠(以pH 6.3的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制)，37 ℃下恒温振荡1 h后转移至离心管中，4 000 r/min离心20 min，取上清液测定胆酸盐含量，代入式(4)计算胆酸盐结合率。

(4)

式中：

S——胆酸盐结合率，%；

A1——胆酸盐加入量，μmol；

A2——剩余量，μmol。

1.3 数据处理与分析

采用Excel进行数据分析，Origin 8.0绘图，SPSS 19.0 进行方差分析，每组试验重复3次，结果表示为(平均值±标准差)。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 乙醇浓度对多酚提取率及DPPH自由基清除率的影响 由图1可知，随着乙醇浓度升高，多酚含量与DPPH自由基清除率不断升高，当浓度达到70%时多酚含量与清除率最高，之后均有所下降。严赞开[21]研究发现80%乙醇提取米邦塔仙人掌中多酚效率最高，与本研究结果相似。这是因为有一部分植物多酚以与蛋白质结合的形式存在，乙醇浓度过高会使蛋白质变性，影响与蛋白质结合的多酚溶出，从而导致多酚提取率下降[22-23]。

图1 乙醇浓度对多酚提取率及DPPH自由基清除率的影响

Figure 1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols and DPPH radical scavenging rate

2.1.2 超声温度对多酚提取率及DPPH自由基清除率的影响 由图2可知：随着温度升高，多酚含量与DPPH自由基清除率不断升高，当温度达到60 ℃时，多酚含量与清除率达到最高，之后均有所下降。一般温度高有利于植物多酚的提取[24]，但高温使超声空化效果受到了影响，而且高温条件下会使乙醇挥发，从而使料液比改变，影响多酚的提取[25]。

图2 超声温度对多酚提取率及DPPH自由基清除率的影响

Figure 2 Effect of ultrasound temperature on extraction rate of polyphenols and DPPH radical scavenging rate

2.1.3 超声时间对多酚提取率及DPPH自由基清除率的影响 由图3可知，随着时间增加，DPPH自由基清除率有所升高，当时间达到50 min时清除率达到最高，之后清除率有所下降；多酚含量随着时间增加不断升高，当时间达到40 min时达到最高点，之后多酚含量有所下降，可能是长时间超声振动导致多酚结构被破坏[26-27]。

图3 超声时间对多酚提取率及DPPH自由基清除率的影响

Figure 3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of polyphenols and DPPH radical scavenging rate

2.1.4 料液比对多酚提取率及DPPH自由基清除率的影响 由图4可知，随着料液比增加，多酚含量与DPPH自由基清除率有所升高，当料液比为1∶15(g/mL)时多酚含量与清除率达到最高，之后均逐渐下降。从节约溶剂的角度考虑，将料液比的范围定为1∶10～1∶20 (g/mL)。

2.2 最佳提取工艺条件的确定

单因素的试验基础上，确定各因素的水平取值见表1。正交试验设计及结果见表2，方差分析见表3。

图4 料液比对多酚提取率及DPPH自由基清除率的影响

Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polyphenols and DPPH radical scavenging rate

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels used for orthogonal array experiments

表2 L9(34)正交试验设计及结果Table 2 L9(34) orthogonal experimental design and results

表3 综合评分方差分析表Table 3 Comprehensive score variance analysis table

由表2可知，以综合评分为评价指标时，用直观分析法分析各因素的主次为超声温度>超声时间>乙醇浓度>料液比，最佳提取方案为乙醇浓度65%，超声温度65 ℃，超声时间45 min，料液比1∶15(g/mL)。由表3可知，乙醇浓度，超声温度和超声时间对综合评分影响显著，料液比对综合评分影响不显著。

准确称取仙人掌粉末1 g，按照正交试验优化的最佳方案进行3次验证实验，结果提取液中多酚含量平均值为20.51 μg/mL，DPPH自由基清除率平均值为87.59%。最终得到仙人掌多酚提取物的最佳提取工艺为乙醇浓度65%，超声温度65 ℃，超声时间45 min，料液比1∶15 (g/mL)。

2.3 米邦塔仙人掌多酚提取物抗氧化性

2.3.1 对羟基自由基的清除能力 由图5可知：米邦塔仙人掌多酚提取物对羟基自由基的清除率随质量浓度的增加而增强。当质量浓度为10 mg/mL时，米邦塔仙人掌多酚提取物的清除率为(93.35±0.42)%，抗坏血酸的清除率为(96.64±0.57)%，可见米邦塔仙人掌多酚提取物对羟基自由基有较强的清除能力。

图5 米邦塔仙人掌多酚提取物对羟基自由的清除能力

Figure 5 Scavenging effect of polyphenol extract fromopuntiamilpaon hydroxyl free radicals

2.3.2 对超氧阴离子自由基的清除能力 由图6可知：米邦塔仙人掌多酚提取物对超氧阴离子自由基的清除率随质量浓度的增加而增强。当质量浓度为25 mg/mL时，米邦塔仙人掌多酚提取物的清除率为(91.79±0.38)%，抗坏血酸的清除率为(97.65±0.73)%，可见米邦塔仙人掌多酚提取物对超氧阴离子自由基有较强的清除能力。

2.4 米邦塔仙人掌多酚提取物降血脂能力

2.4.1 体外胆固醇吸附能力 试验结果显示：米邦塔仙人掌多酚提取物在pH 2条件下与胆固醇的吸附能力为(10.46±0.78) mg/g，在pH 7条件下与胆固醇的吸附能力为(14.65±0.82) mg/g，与张煜等[28]对扁枝槲寄生乙醇粗提物的体外胆固醇吸附能力相比，仙人掌多酚提取物的胆固醇吸附量显著提升。

图6 米邦塔仙人掌多酚提取物对超氧阴离子自由基的清除能力

Figure 6 Scavenging effect of polyphenol extract fromopuntiamilpaon superoxide anion free radicals

2.4.2 体外胆酸盐吸附能力 由图7可知：米邦塔仙人掌多酚提取物与胆酸盐结合能力随质量浓度的增加而增强，当质量浓度为25 mg/mL时，米邦塔仙人掌多酚提取物与甘氨胆酸钠结合率为(34.13±0.37)%，与牛磺胆酸钠结合率为(28.34±0.64)%，说明多酚提取物与甘氨胆酸钠的结合能力更强。与夏雨等[29]对佛手果提取物的研究相比，仙人掌多酚提取物的胆酸钠吸附能力要显著高于佛手果提取物的胆酸钠吸附能力，说明仙人掌多酚提取物具有较好的降血脂能力。

图7 米邦塔仙人掌多酚提取物胆酸盐结合能力

Figure 7 The binding capacity of polyphenol extract fromopuntiamilpaon bile salts

3 结论

试验采用超声波辅助法提高米邦塔仙人掌多酚得率，以多酚含量和DPPH自由基清除率为指标，选择料液比、乙醇浓度、超声温度、超声时间为单因素，并通过正交试验进行提取条件的优化，得到的最佳提取工艺为料液比1∶15(g/mL)，乙醇浓度65%，超声温度65 ℃，超声时间45 min，在此条件下，多酚含量为20.51 μg/mL，DPPH清除率为87.59%。米邦塔仙人掌多酚提取物具有良好的抗氧化活性，在其浓度为10 mg/mL时，羟基自由基清除能力与超氧阴离子清除能力分别达到93.35%，59.83%。体外降血脂试验结果表明米邦塔仙人掌多酚提取物在pH 2和pH 7条件下与胆固醇的吸附能力分别为10.46，14.65 mg/g；在其浓度为25 mg/mL时与甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠结合率分别为34.13%，28.34%，表明多酚提取物具有体外降血脂能力。后续将对米邦塔仙人掌提取物在体内的抗氧化、降脂功能及其作用机理作进一步的研究与探讨。