芝麻茎点枯病菌产生的几种细胞壁降解酶活性分析

高树广，徐博涵，张春花，王瑞霞，赵 辉，倪云霞，刘红彦，杨光宇，李伟峰

（1.周口市农业科学院，河南周口466001；2.河南省农业科学院植物保护研究所，河南郑州450002）

芝麻是最古老的油料作物之一[1]，在温带、热带地区广泛种植[2-3]，但是芝麻单产不稳定，除受遗传因素影响外，病、虫、草等生物因子或渍、旱等非生物因子的胁迫，也是造成芝麻单产低而不稳的重要因素[4-5]，其中，茎点枯病是世界范围内危害芝麻最严重的土传、种传真菌病害之一，在我国常年发病率20%左右，发病严重的田块达到80%以上，重病田几乎颗粒无收，不但影响芝麻的产量和品质，而且严重影响芝麻生产的机械化[6-7]。芝麻茎点枯病菌为菜豆壳球孢，学名Macrophomana phaseolina（Tassi），Goid.），简称M. phaseolinna，抗逆能力很强[8]，寄主广泛，能侵染芝麻、大豆、向日葵、玉米、大豆、烟草、蓖麻、番茄、棉花等500 多种作物[9-10]。

植物病理学认为，细胞壁降解酶是病原菌“基本的亲和因子”，它们是病菌侵染、扩展、从植物中获取营养所必需的，不同的病原菌在致病过程中分泌的细胞壁降解酶种类和作用不同，多种细胞壁降解酶协同作用，是病原真菌降解宿主组织的重要机制。陈捷等[11]研究表明，玉米茎腐病菌产生的细胞壁降解酶在胚根组织的降解中起重要作用；水稻纹枯病菌通过产生的多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基半乳糖醛酸酶和纤维素酶侵染水稻叶鞘[12]。植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素、木质素、果胶和蛋白质等构成[13]，半纤维素和木质素在高等植物细胞中分布广泛，二者通过共价结合包裹纤维素，形成稳固的超分子体系，此分子体系不但增强植物体的机械强度，而且能防止有害生物和过多水分渗入细胞壁，起到保护和支持作用。木质素主要分布在胞间层和次生内壁，作为纤维素外围基质，保护纤维素免受降解酶进攻和微生物袭击。木质素降解的胞外酶主要包括漆酶（Lac）、锰过氧化物酶（MnP）、木质素过氧化物酶（LiP）及一些辅助酶[14-15]。半纤维素是一种异质多聚体，由不同类型的五碳糖和六碳糖构成，木聚糖是主要的组成成分。半纤维素酶是木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶和阿拉伯半乳糖酶等多组酶的总称[16]。陈晓林等[17]研究表明，细胞壁降解酶是苹果腐烂病菌的主要致病因子，致病性强的菌株木聚糖酶活性显著高，并且酶活力峰值出现也比较早。目前，国内外对茎点枯病症状的描述、发生规律和防治方法等研究较多，而对病原菌致病机制的研究相对薄弱[18-20]，因此，明确芝麻茎点枯病菌产生的细胞壁降解酶种类及活性，对进一步研究芝麻茎点枯病菌与寄主的互作机制具有重要意义。

本试验通过测定芝麻茎点枯病菌产生的纤维素降解酶种类及活性大小，为芝麻茎点枯病菌侵染寄主的机制研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 7 株芝麻茎点枯病菌均由河南省农业科学院植物保护研究所生物防治研究室分离和保存（表1）。

表1 供试菌株

1.1.2 试剂与仪器 木糖、木聚糖、藜芦醇和ABTS购自北京索莱宝生物科学技术有限公司，均为色谱纯；pH 计为Sartorius PB-10，分光光度计为岛津紫外分光光度计-UV2450。

1.1.3 培养基 芝麻秆粉：芝麻秆洗净、蒸馏水冲洗2 遍，80 ℃烘干，粉碎至0.177 mm，2 mol/L NaOH溶液（固液质量比为1∶4）处理12 h，水洗至pH 中性，烘干备用[21]；液体发酵培养基：芝麻秆粉20 g，NH4Cl 2.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Na2HPO40.2 g，CuSO4·5H2O 0.007 g，MnSO40.035 g，FeSO4·7H2O 0.007 g，蒸馏水1 000 mL，pH 值调至6.8～7.0[22]；DNS 试剂：6.5 g 3，5- 二硝基水杨酸溶于少量蒸馏水中，加入325 mL 2 mol/L 的NaOH 溶液、45 g 丙三醇，摇匀冷却后定容至1 000 mL[23]。

1.2 方法

1.2.1 木糖标准曲线 取7 支洁净的10 mL EP 管分别加入一定体积的2 mg/mL 的木糖标准溶液，不加标准溶液为空白对照，ddH2O 定容至2 mL，配制成木糖梯度浓度溶液，摇匀后分别加入2 mL DNS 溶液，摇匀后沸水浴5 min，取出冷至室温，在540 nm波长下测定吸光度（OD值），以木糖质量浓度（mg/mL）为纵坐标、对应的吸光度为横坐标，绘制木糖标准曲线。

1.2.2 粗酶液制备 将斜面保存的菌株接至PDA平板上，30 ℃黑暗培养2 d，从菌落边缘打菌饼转至新的PDA 平板上，30 ℃培养2 d，菌落边缘打菌饼（直径为6 mm）转接至含200 mL 液体发酵培养基的500 mL 锥形瓶中，30 ℃，160 r/min 振荡培养，以不接菌的液体发酵培养基作为空白对照，3 次重复，每次取样8 mL，4 ℃，10 000 r/min 离心10 min，上清液即为粗酶液[24]，采用3，5- 二硝基水杨酸法（DNS法）测定酶活力。

1.2.3 木聚糖酶活测定 洁净干燥10 mL EP 管中加入1.5 mL1%木聚糖缓冲液，然后加入酶液0.5 mL，50 ℃水浴中保温30 min，反应完毕后，立即取出，加入2 mL DNS 溶液终止酶反应。充分摇匀后沸水浴5 min，冰浴冷却，在540 nm 波长下测定OD 值，从第2 天开始，每隔1 天测定一次。根据OD 值，在标准曲线上查找木糖浓度，再根据木糖浓度计算出相应的酶活力。酶活力单位（U/mL）定义为：1 mL 酶液1 min 催化底物水解生成1 μmol 木糖[24]，酶活力计算公式如下。

酶活力（U）＝木糖质量浓度（mg/mL）×反应液体积（mL）×6.67（μmol/mg）/反应液中加入酶液体（mL）×时间（min） （1）

其中，6.67 为1 mg 木糖的μmol 数。

1.2.4 木质素降解酶活测定 木质素过氧化物酶（LiP）测定：病原菌液体发酵培养14 d 制取粗酶液，藜芦醇法[25]测定木质素过氧化物酶活力，2.6 mL反应液（80 mmol/L、pH 值3.0 的酒石酸钠缓冲液，5 mmol/L 藜芦醇）中加入0.3 mL 酶液，首先预热至37 ℃，往此反应液中加入0.1 mL 10 mmol/L H2O2启动酶促反应，测定310 nm 吸光度在2 min 内的变化。单位时间内1 mL 酶液使反应体系吸光度增加0.01 定义为1 个酶活力单位（U）。

锰过氧化物酶（MnP）测定：病原菌液体发酵培养14 d 制取粗酶液，二价锰氧化法测定锰过氧化物酶活力[26]，在4.0 mL 反应体系中，含有3.4 mL 50 mmol/L乳酸钠缓冲液（pH 值4.5）、0.1 mL1.6 mmol/L 硫酸锰溶液，酶液0.4 mL，预热至37 ℃，然后加入0.1 mL1.6 mmol/LH2O2溶液启动酶促反应，240 nm处测定最初4 min 内吸光度的变化。单位时间内1 mL酶液使反应体系吸光度增加0.01 定义为1 个酶活力单位（U）。

漆酶（Lac）测定：病原菌液体发酵培养14 d 制取粗酶液，ABTS 法测定漆酶活力[27]，在4.0 mL 反应体系中含有0.3 mL 0.3 mmol/L 的ABTS、3.65 mL 柠檬酸- 磷酸盐缓冲液（pH 值2.6），酶液0.05 mL，混合后在420 nm 处测定最初5 min 内吸光值的变化。每分钟吸光值变化0.01 单位所需要的酶量为一个Lac 酶活力单位。

1.3 数据分析

采用SPSS 17.0 对试验数据进行统计分析，Duncan 新复极差法进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 木糖标准曲线绘制

以吸光度为横坐标、木糖质量浓度为纵坐标绘制标准曲线，得到木糖对应线性方程为y＝0.165 4x＋0.001 6（R2＝0.999 9）（图1），标准曲线线性关系良好，可用于酶活力测定。

2.2 木聚糖酶活分析

从图2 可以看出，接种第2 天就有一定的产酶量，取样7 次，7 株病原菌均能检测到木聚糖酶，表明7 个菌株均能分泌胞外降解木聚糖的酶。各菌株酶活性均高于第2 天测定结果，并且达到峰值的时间不同（表2），其中，2010003 达到峰值所用时间最短，在第6 天达到峰值，其余菌株在第12 天出现峰值，其峰值大小依次是2010082＞2010003＞2010028＞2010032＞G243＞2010010＞2010064，其中，2010082峰值最大（2.538），2010064 峰值最小（1.533）；参照病害严重度进展曲线下面积（AUDPC）法计算酶活性发展曲线下面积（the area under enzyme activity progresscurve，AUEAPC，简称A值），7 个菌株A值[28-29]差异极显著，从大到小依次为2010003＞2010082＞2010028＞2010032＞G243＞2010010＞2010064，其中，2010003 的A 值最高（26.634），2010064 的A 值最低（16.130）。

表2 芝麻茎点枯病菌木聚糖酶活力峰值和A 值差异比较

2.3 木质素降解酶活性分析

木质素降解酶测定结果显示，7 株病原菌都能检测到木质素过氧化物酶和漆酶，但均未检测到锰过氧化物酶。同一菌株不同酶相比较，木质素过氧化物酶活性都明显高于漆酶活性（图3）；对不同菌株木质素过氧化物酶、漆酶进行多重比较，结果表明，菌株2010028 的木质素过氧化物酶活性（3.522）和漆酶活性（0.783）均最高，G243 的木质素过氧化物酶活性最低（0.656），2010082 的漆酶活性最低（0.099）（表3）。

表3 芝麻茎点枯病菌木质素降解酶活性不同菌株之间多重比较

3 讨论

研究病原菌的致病因子是明确其致病机制和探索植物抗病途径的重要基础，大多数植物病原菌都能分泌各种细胞壁降解酶，不同病原菌分泌细胞壁降解酶种类不同，同一种病原菌不同菌株分泌同一种酶的活力大小也存在差异[30]。试验结果表明，以芝麻秸秆为唯一碳源的液体培养基，培养不同地区采集的7 株芝麻茎点枯病菌，从培养液中制取的粗酶液中都能检测到木聚糖酶、木质素过氧化物酶和漆酶，但是未检测到锰过氧化物酶，说明7 株病原菌都具有降解半纤维素和木质素的能力。7 株病原菌接种第2 天就能检测到木聚糖酶活性，在培养的14 d 中能持续产生木聚糖酶，并且每天的酶活力不同，出现酶活力峰值的时间不同，以A 值作为木聚糖酶综合活性高低的依据[31]，不同菌株之间差异显著，2010003 综合活性最高，2010064 综合活性最低；不同菌株木质素降解酶活力差异比较显著，无论是木质素过氧化物酶活力还是漆酶活力，2010028 都显著高于其他菌株。同一种酶不同菌株活力大小差异比较显著，是由于病原菌产生胞外细胞壁降解酶的机制比较复杂，除受底物诱导外，还与基因调控和环境因子有关，作为芝麻茎点枯病菌的致病因子，推测木聚糖酶、木质素过氧化物酶和漆酶在不同菌株入侵、扩展中起作用大小不同。另外，芝麻茎点枯病菌侵染芝麻，除细胞壁降解酶外，还有激素和毒素等因子的共同作用才能致病，是一个复杂的生化过程；同时，病原菌侵染也会激活植物防御酶系统、诱导植物产生抗菌物质来抑制病原菌细胞壁降解酶，以达到抗病的目的[32]。因此，本试验为芝麻茎点枯病菌与寄主互作机制研究奠定了重要基础，要彻底明确芝麻茎点枯病菌产生的纤维素降解酶对病原菌入侵寄主、病斑扩展的影响及其致病机制，根据病原菌致病因子鉴定程序，还需将病原菌以及分离纯化之后的酶，接种活体芝麻，对病原菌的致病性强弱及致病性强弱与这几种酶的相关性进行进一步探讨[17]。