贵州分布树蛙科泛树蛙属两新记录种——凹顶泛树蛙、布氏泛树蛙

肖宁， 罗庆华， 罗涛， 魏芳， 曾亚军

(1.贵阳护理职业学院，贵阳550081； 2. 贵州师范大学生命科学学院，贵阳550001；3.荔波县世界自然遗产管理局，贵州荔波558400； 4. 贵州省林业科学研究院，贵阳550004)

树蛙科Rhacophoridae泛树蛙属Polypedates广泛分布于印度东部、菲律宾和婆罗洲以及东南亚等地区，目前该属记录有24种(Frost，2018)，中国分布有4种(Frost，2018；中国两栖类，2018)，这4个物种各自成单系，均属于Polypedatesleucomystax复合体(Kuraishietal.，2013；Panetal.，2013)。该属物种的分类研究存在一定争议(Brownetal.，2010；Sheridanetal.，2010；Riyantoetal.，2011；Kuraishietal.，2013)。基于前人的相关研究(Lietal.，2008，2009；Brownetal.，2010；Kuraishietal.，2013)，Pan等(2013)基本理清了东南亚分布泛树蛙属物种的分类地位，确定了中国分布有泛树蛙属物种4种，即布氏泛树蛙Polypedatesbraueri、凹顶泛树蛙Polypedatesimpresus、斑腿泛树蛙Polypedatesmegacephalus和无声囊泛树蛙Polypedatesmutus。然而，泛树蛙属物种在形态性状上的保守性以及繁殖方式和栖息地环境的相似性，物种间的分类地位及分布目前仍存在较大争议。

目前，斑腿泛树蛙和无声囊泛树蛙被广泛记录于贵州省各区县(伍律等，1986；陈继军等，2007；李仕泽等，2015；黄静等，2016；魏刚等，2017；姚正明等，2018)。在以往研究中(Yuetal.，2009；Brownetal.，2010；Kuraishietal.，2013；Lietal.，2013；Panetal.，2013)，除Li等(2013)使用了来自贵州省贵阳地区的1号样本外(样本编号：LJTV96)，其他研究均缺乏来自贵州地区的泛树蛙属物种样品。因此，关于贵州地区泛树蛙属物种的组成和分布记录有待进一步厘定。

2016—2018年在贵州茂兰国家级自然保护区、黄平县朱家山县级自然保护区进行本底资源调查时采集到数只泛树蛙属物种标本，基于形态学比较和分子系统学分析鉴定为布氏泛树蛙和凹顶泛树蛙，为贵州省2新记录。本研究对贵州分布的布氏泛树蛙和凹顶泛树蛙进行了形态学描述，并补充了其分子生物学数据。

1 材料与方法

1.1 材料

样品采自贵州茂兰国家级自然保护区(108°01′24.02″E，25°13′28.90″N，海拔528 m；以下简称贵州茂兰)、贵州省黄平县朱家山县级自然保护区(107°39′44.49″E，26°54′35.23″N，海拔833 m；以下简称贵州黄平)，共11号成体标本(4号斑腿泛树蛙、3号凹顶泛树蛙和4号布氏泛树蛙)，对其中6雄2雌(斑腿泛树蛙3号雄性、凹顶泛树蛙1号雌性和布氏泛树蛙3号雄性、1号雌性)进行了形态学性状测量，取腿部肌肉保存于90%乙醇；10%福尔马林浸泡标本，保存于贵州师范大学生命科学学院动物生态学标本室。

1.2 DNA提取、扩增和测序

总DNA提取自保存于90%乙醇中的标本腿部肌肉，使用DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN Catalog No.69504)。选择12S-16SrRNA基因片段作为分子标记，扩增引物为FS01：5’-AACGCTAAGATGAACCCTAAAAGTTCT-3’；Rend：5’-GACCTGGATTACTCCGGTCTGA-3’(刘秋成等，2018)。扩增产物由成都擎科梓熙生物技术有限公司双向测序。

1.3 系统发育分析

测序后在NCBI进行Blast比对，确定所扩增片段为12S-16SrRNA基因。在进行系统发育分析时，选择Pan等(2013)使用的泛树蛙属物种12S-16SrRNA序列，以Polypedatesotilophus、P.colletti、P.maculatus、Polypedatessp.和P.macrotis为外群进行系统发育分析(表1)。

用贝叶斯法(BI)和最大似然法(ML)构建系统发育树来确定本研究样本的分类地位。最适模型基于赤池信息准则(AIC)在PartitionFinder 2(Lanfearetal.，2012)进行模型选择(最适模型为GTR+I+G)。BI分析在MrBayes 3.2(Ronquistetal.，2012)进行(参数设置为nruns=4，ngen=2 000 000，samplefreq=100，nchains=4，burnin=5 000)。在Tracer 1.6(Rambautetal.，2013)中查看了相关运行参数的收敛性和有效样本量。在IQ-TREE(Nguyenetal.，2014)中运行1 000次Bootstrap重复抽样分析(运行模型与贝叶斯相同)。在MEGA 7.0中以物种为组采用分组的方法计算贵州样品与Polypedatesleucomystax复合体物种间的遗传距离(p-distances)。

1.4 形态学数据测量

依据费梁等(2009)，使用游标卡尺(Serial No.14133868，德国)测量25个形态特征(精确度0.01 mm)：体全长(SVL)、头长(HDL)、头宽(HDW)、吻长(SL)、眼径(ED)、鼓膜径(TD)、眶间距(IOS)、上眼睑宽(UEW)、鼻间距(IND)、鼻眼距(NED)、鼻吻距(NSD)、鼓膜距离眼后角的距离(ETD)、两眼前角距(IFE)、两眼后角距(IAE)、前臂及手长(LAL)、前臂宽(LW)、手长(HL)、腿长(THL)、胫长(TL)、胫宽(TW)、附足长(TFL)、足长(FL)、第三指吸盘宽(FDW)和第四趾吸盘宽(DPW)。

2 结果

2.1 系统发育分析

将采自贵州茂兰、贵州黄平的11号泛树蛙标本的12S-16SrRNA序列上传到GenBank，登录号详见表1。对泛树蛙属10个物种共计57号标本的12S-16SrRNA序列进行多重序列比对拼接后的碱基长度为2 368 bp。基于12S-16SrRNA序列计算的泛树蛙属物种间遗传距离为1.19%～8.79%(表2)。本研究采自贵州茂兰的泛树蛙标本(GenBank登录号：MK481032、MK481033、MK481034)与Pan等(2013)的凹顶泛树蛙之间的遗传距离为1.19%，贵州黄平和茂兰的泛树蛙标本(GenBank登录号：MK481039、MK481029、MK481030、MK481031)与Pan等(2013)的布氏泛树蛙之间的遗传距离为1.49%，贵州茂兰的泛树蛙标本(GenBank登录号：MK481035、MK481036、MK481037、MK481038)与Pan等(2013)的斑腿泛树蛙之间的遗传距离为2.32%(表2)。

表1 本研究中使用的样本和序列的GenBank登录号Table 1 Samples used in this study and GenBank accession numbers for sequences

种名Species标本号Voucher ID采集地LocalitiesGenBank登录号GenBank accession number来源ReferencesP. leucomystaxMZB UNTemanggung, Java, IndonesiaAB728135Kuraishiet al., 2013JAM 3211Lombok Island, IndonesiaHM770313Brown et al., 2010MZB Amp 12864Banyuwangi, Java, IndonesiaAB728137Kuraishiet al., 2013KUHE 23555Brostagi, Sumatra, IndonesiaAB728128Kuraishiet al., 2013BORN 23373Keningau, Sabah, MalaysiaAB728143Kuraishiet al., 2013BORN 22430Tampaluri, Sabah, MalaysiaAB728144Kuraishiet al., 2013FMNH 244922Sabah, MalaysiaHM770266Kuraishiet al., 2013FMNH 231040Sabah, MalaysiaHM770281Brown et al., 2010外群P. otilophusKUHE 42555Kanowit, Sarawak, MalaysiaAB728190Kuraishiet al., 2013P. collettiMZB UNLampung, Sumatra, IndonesiaAB728189Kuraishiet al., 2013P. maculatusKUHE 42336Rajgir, Bihar, IndiaAB728188Kuraishi et al., 2013P. macrotisKUHE 42556Kanowit, Sarawak, MalaysiaAB728187Kuraishiet al., 2013Polypedates sp.KUHE 52552Temerloh, Pahang, MalaysiaAB728185Kuraishiet al., 2013

注：*标本保存于贵州师范大学生命科学学院动物生态实验室， 由罗涛采集

Notes：*the specimens are kept in the Animal Ecology Laboratory， School of Life Sciences， Guizhou Normal University， all samples were collected by Luo Tao

表2 Polypedates leucomystax复合体物种间的遗传距离Table 2 Uncorrected pairwise distances among species in the Polypedates leucomystax complex

注：#来自贵州泛树蛙属物种样品

Note：#Polypedatesspecies were from Guizhou province

基于BI和ML构建的系统发育树产生了相同的拓扑结构(图1)，仅在末端分支节点上存在一些差异。从系统发育树可知，来自贵州黄平的泛树蛙样本(GenBank登录号：MK481029、MK481030、MK481031)和贵州茂兰的样本(GenBank登录号：MK481039)与布氏泛树蛙聚为一支(BPP=1.00，BSP=80)，来自贵州茂兰的样本(GenBank登录号：MK481035、MK481036、MK481037、MK481038)与斑腿泛树蛙聚为一支(BPP=1.00，BSP=99)，来自贵州茂兰的样本(GenBank登录号：MK481032、MK481033、MK481034)与凹顶泛树蛙聚为一支(BPP=1.00，BSP=10)，与Pan等(2013)的研究有相似的树形拓扑结构。

系统发育分析的结果表明，采自贵州茂兰、黄平的泛树蛙属物种标本为布氏泛树蛙(GenBank登录号：MK481039、MK481029、MK481030、MK481031)、凹顶泛树蛙(GenBank登录号：MK481039、MK481029、MK481030、MK481031)及斑腿泛树蛙(GenBank登录号：MK481035、MK481036、MK481037、MK481038)。

图1 基于线粒体12S rRNA和16S rRNA基因构建的Polypedates leucomystax复合体的系统发育树Fig. 1 Phylogenetic tree of Polypedates leucomystax complex constructed based on mitochondrial 12S rRNA and 16S rRNA gene

红色表示来自本研究的样本

Red indicates the samples used in this study

2.2 鉴定与形态描述

2.2.1 布氏泛树蛙的形态特征雄蛙体长约53.11 mm，雌蛙约56.57 mm(表3)；头宽与头长约等宽；吻前端钝，鼻孔近吻端；眶间距约为上眼睑距的4/3；鼓膜直径约为眼径的2/3；颞褶显著；内鼻孔位置靠后，几乎达眶前缘，左右分开较大；犁骨齿长，略向后斜列，左右相距较窄；指、趾端均具吸盘，指吸盘大于趾吸盘，但小于鼓膜直径；第一指长小于第二指长，指关节下瘤明显；贴体前伸达眼前端；趾蹼约为3/4；内蹠突大而突出，椭圆形，无外蹠突。

体背皮肤较为光滑，疣粒细小，但腹部及四肢腹侧皮肤较为粗糙；自眼后角开始，身体两侧各有一窄细肤褶，有的个体经前臂上方一直延伸至腹股沟区，但大多数个体此肤褶较短，经肩部上方向下延伸而止于靠近前肢下方处。浸泡标本背部浅灰色或深棕灰色；眼眶间靠近上眼睑处可见略呈三角形的浅黑色斑纹；背部散有不规则黑色小斑块；体侧皮肤有较多的黑色斑点；四肢背侧横纹清晰；股部后方有多个较大白色斑点，斑点之间的皮肤颜色为深黑色，此特征在浅灰色的浸泡标本里面更显著；腹侧皮肤黄白色(图2，图3)。

表3 贵州分布3种泛树蛙物种的测量性状量度Table 3 Morphological traits of 3 Polypedates species in Guizhou province

2.2.2 凹顶泛树蛙的形态特征雌蛙体长约69.59 mm(表3)；身体扁而窄长；头部扁平，头长宽几相等，头顶下凹明显，头顶皮肤紧贴额顶骨，不能分离；吻端钝尖，略超过下颌；吻棱显著；鼓膜圆，紧接眼后，小于上眼睑宽；犁骨齿列长，横列在内鼻孔前内侧，左右不相遇；背侧褶无；前肢较粗壮，前臂及手长约为体长之半；指端有大的吸盘，其腹面边缘有马蹄形沟，第一指吸盘较小；指长顺序：3>4>2>1，第四指略短于第三指；指间一般无蹼或略显蹼迹，指侧均有缘膜；关节下瘤大而明显，指基下瘤明显；掌突2个。后肢较细长，约为体长的1.7倍，后肢前伸贴体胫附关节达吻端或鼻孔；胫长约为体长之半，左、右跟部不重叠，足长小于胫长；趾长顺序：4>5>3>2>1，第五趾略长于第三趾；趾间具蹼，缺刻深，第四趾外侧蹼达第一、第二关节下瘤之间，其余各趾以缘膜达趾端；外侧趾间蹼不甚发达；关节下瘤显著，蹠部有成行小疣；内蹠突细窄，外蹠突小而不显；指、趾端均具吸盘和边缘沟；指、趾吸盘背面可见“Y”形迹；指细长无蹼；外侧蹠间约具1/2蹼，趾间半蹼；有内蹠突，无外蹠突。

图2 贵州省分布的3种泛树蛙
Fig. 2 ThreePolypedatesspecies distributed in Guizhou province

A1～A7.凹顶泛树蛙Polypedatesimpresus， B1～B2. 斑腿泛树蛙P.megacephalus， C. 布氏泛树蛙P.braueri

图3 凹顶泛树蛙、斑腿泛树蛙和布氏泛树蛙在保存状态下的背侧(A1、B1、C1)、 腹侧(A2、B2、C2)和左侧(A3、B3、C3)Fig. 3 Dorsal (A1， B1， C1)， ventral (A2， B2， C2)， and lateral (A3， B3， C3) views ofPolypedates impresus， P. megacephalus and P. braueri in preservation

皮肤较光滑，头顶部皮肤与头骨相连；背面满布均匀小疣粒；颞褶平直，达肩部逐渐消失，鼓膜后方至肩部上方为黑色。胸腹部、体侧及股下方密布扁平圆疣。

背部为棕色或棕褐色，具“X”形斑纹，隐或不显，具不均匀的小黑斑，咽胸部较光滑，胸腹部和股腹面密布扁平疣。头体及股部腹面乳白或乳黄色，仅咽喉部略褐色斑点；整个背面为浅棕色，体背面无斑纹或在肩部略显“X”形斑；上唇缘白色，颞部有1条棕色横纹；四肢背面均有深棕色横纹，体侧无斑；股后部无灰褐色网状斑纹；前肢腹面和胫、跗、足部腹面为浅肉色，且具小麻斑；肛部有乳白色的扁平疣粒(图2，图3)。

2.3 生态环境及其习性

本研究的凹顶泛树蛙、布氏泛树蛙和斑腿泛树蛙栖息环境相似，均生活在530～800 m的山间农田及其旱地生境中，周围水域以静水域为主，常栖息生活于稻田、草丛中，周围乔灌木甚少。同域分布的泽陆蛙Fejervaryamultistriata、饰纹姬蛙Microhylafissipes、小弧斑姬蛙Microhylaheymonsi和黑斑侧褶蛙Pelophylaxnigromaculata为优势种。

5月可见大量个体交配，卵泡产于静水域稻田的水稻幼苗和周围的草丛近水处。约1周孵化完毕，蝌蚪进入静水即可游动。

3 讨论

泛树蛙属物种间的形态差异较小，繁殖模式和栖息地环境极为相似，中国大陆地区长期以来被认为由斑腿泛树蛙和无声囊泛树蛙组成(费梁等，2009，2012)。近年来，基于分子系统学的研究基本理清了东南亚地区泛树蛙属物种的分类地位(Kuraishietal.，2013；Panetal.，2013)。贵州省地处中国西南部，位于第二阶梯之上，并处于第一阶梯向第二阶梯的过渡地段。较多的新物种在该地区被描述(徐宁等，2007；李松等，2008a，2008b，2010；Zhaoetal.，2008；Yangetal.，2011；王超等，2013；Wangetal.，2013；Heetal.，2015；Dengetal.，2016；Chenetal.，2017；Zhangetal.，2017；Liuetal.，2018；Lietal.，2018；李春青等，2018；Wuetal.，2018)。这表明该地区的物种多样性较高，其物种多样性在以往可能被低估。依据泛树蛙属物种背部的斑纹，即“X”形斑或者背部纵纹的数目，贵州地区该属物种被记录为斑腿泛树蛙和无声囊泛树蛙(伍律等，1986；陈继军等，2007；李仕泽等，2015；黄静等，2016；魏刚等，2017；姚正明等，2018)，但采用物种的体色和体背“X”形斑等特征并不能准确区分这2个物种(刘秋成等，2018)，因而，依据背部“X”形斑作为分类依据将贵州地区泛树蛙属物种分类为斑腿泛树蛙和无声囊泛树蛙还有待进一步研究。本研究结果表明，贵州地区目前应该分布有泛树蛙属物种3种，即布氏泛树蛙、凹顶泛树蛙和斑腿泛树蛙，但这3个物种的分布范围和是否有无声囊泛树蛙在贵州的分布有待使用分子标记并结合形态学特征进行研究。

致谢：感谢荔波世界自然遗产管理局生物多样性监测项目资助、黄平县朱家山县级自然保护区工作人员在调查过程中提供的帮助。