SOCS3在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达研究

李德军，郎丹丹，翁蔚琪

(1.台州市肿瘤医院，浙江 温岭 317500；2.珠海市人民医院，广东 珠海 519000)

细胞因子信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling，SOCS3)与肿瘤细胞的持续增殖和机体的抗肿瘤免疫能力密切相关。SOCS3表达的下调使信号转导子和转录激活子3(singal transducer and activator of transcription 3，STAT3)持续磷酸化不仅促进白血病细胞增殖和抗凋亡基因产生，而且干扰机体抗肿瘤免疫，影响微小病变残留的清除并增加复发的风险[1-2]。近年来，人们开始尝试通过干扰肿瘤生长和存活中所依赖的信号通路来治疗癌症，相对于化疗而言，这种新方法能够很好地区分正常细胞和肿瘤细胞，因而能更特异地杀死肿瘤细胞，而不损伤正常细胞。本研究测定了SOCS3在儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)中的表达情况、SOCS3表达异常对STAT3表达水平的影响、SOCS3表达水平高低与儿童ALL疾病状态及危险度之间的关系，同时测定了ALL患儿STAT3 mRNA表达水平及CD4+CD25+CD127low调节性T细胞水平，探讨SOCS3在儿童ALL疾病状态和危险度评估、肿瘤免疫及靶向治疗中的应用情况。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂

Ficoll分离液，天津生物科技有限公司；小牛血清，扬州四季青有限公司；二甲基亚砜(DMSO)，天津生物科技有限公司；TRIzol Reagent，美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒，美国Themero Scientific公司；SYBR-GREEN试剂盒，美国Themero Scientific公司；抗人SOCS3抗体，苏州生物技术有限公司；藻胆色素蛋白(phycoerythrin，PE)标记的鼠抗人IgG抗体，美国eBioscience公司；异硫氰酸荧光素酯(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的抗人CD4，美国eBioscience公司；别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)标记的抗人CD25抗体及同型对照抗体，美国eBioscience公司；PE标记的抗人FOXP3试剂及同型对照抗体，美国eBioscience公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.2研究对象

选择2016年1月至2017年1月就诊于台州市肿瘤医院儿科血液病区的新诊断ALL患儿45例为研究对象(ALL组)。入组对象为年龄在1个月至18岁的ALL患儿，对ALL诊断符合法美英合作组(French-American-British cooperative group，FAB)诊断标准；排除成熟B-ALL、混合表型白血病、第二肿瘤、免疫缺陷病、非初治。所有入组患儿按照中国儿童肿瘤协作组(Chinese Children’s Cancer Collaboration Group，CCCG)-ALL-2015方案化疗，一般分为诱导缓解、巩固治疗、继续治疗阶段。同时选择13名健康儿童为正常对照组，因对照组健康儿童标本资料获取困难，研究选择了停药的ALL患儿作为正常对照组。按照儿童ALL患者治疗结束后复发率约为6%，如缓解能够持续4年，此时复发几率<1%，可被定义为“治愈”，因此研究选择停药至少5年的13例ALL患儿为正常对照组。所有患儿家长在入组时均签署化疗同意书、废弃标本可用于科研同意书。两组儿童基线资料比较见表1。

项目ALL组(n=45)对照组(n=13)t/χ2P男/女23(51.1)/22(48.9)7(53.8)/6(46.2)0.560.432年龄(岁)5.8±1.65.5±1.30.230.759 ≤1038(84.4)10(76.9) >107(15.6)3(23.1)白细胞(×109/L)22.0±12.36.5±2.352.630.001 ≤5029(64.4) >5016(35.6)血红蛋白(g/L)70.6±25.3108.7±12.316.520.001血小板(×109/L)42.3±25.4156.7±36.836.520.001乳酸脱氢酶(IU/L)534.5±153.7265.2±121.542.620.001骨髓原始细胞(%)82.6±32.3白血病细胞起源 B-ALL42(93.3) T-ALL3(6.7)危险度分组 低危组16(35.6) 中危组20(44.4) 高危组9(20.0)融合基因 TEL/AML6(13.3) BCR/ABL4(8.9) POX1(2.2) MLL1(2.2)

1.2方法

1.2.1骨髓单个核细胞的提取

使用乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管分别采集ALL组45例患儿初诊时、完全诱导缓解期，以及13例正常对照组儿童新鲜骨髓液4mL，用等体积0.01mol/L的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)稀释、混匀；取10mL无菌的离心管，加入比重为1.077/mL的淋巴细胞分离液约4mL，将稀释后的骨髓在离液面约1cm处缓慢滴加，使其形成一明显分界面，上下液面切勿混合；水平离心机以1 800g/min离心15min后，小心取出无菌离心管，可见离心管中细胞从上而下分为四层，第一层为血浆层、第二层为乳白色淋巴细胞层、第三层为透明分离液层、第四层为红细胞层；小心吸取位于第二层的乳白色淋巴细胞层至新的无菌离心管内，用移液枪吸取20μL用于计数，余用7～10倍体积0.01mol/L的PBS液稀释，以1 500g/min离心10min后，留取底层细胞，用0.01mol/L的PBS液洗涤2～3次；去上清液，取约2×107个细胞用于流式细胞分析，余加入冻存液，分装3管至1.5mL无菌冻存管内，各管细胞数为2×107个，放入液氮中冻存备用。

1.2.2逆转录和PCR反应

取出冻存的RNA样本，常温下溶解后，取少量RNA溶液用二乙基焦磷酰胺(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水稀释(1:100)后，微量光度计测定所有RNA样本A260/A280为1.8～2.0；将逆转录试剂盒(Thermo K1622)于-20℃冰箱保存，融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心，离心后置于冰上。设置无逆转录酶的阴性对照(NTC)，NTC可用于评估基因组DNA对RNA样品的污染状况。设置阳性对照，阳性对照试剂盒中已经提供阳性对照所需的RNA模板和基因特异性引物。人磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)对照RNA(1.3kb)是通过体外转录方式得到的，GAPDH特异性引物与人、小鼠、大鼠的GAPDH基因完全互补，RT-PCR后的产物长度大约496bp。引物由Invitrogen公司合成，具体步骤严格按照试剂盒说明进行操作。

1.2.3流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg细胞

选择合适流式管，做好标记，各管中分别加入100μL细胞悬液；分别加入CD4、CD25抗体及同型对照，CD25同型对照管加CD4抗体和CD25同型对照抗体；CD4 CD25管加CD4抗体和CD25抗体，Foxp3同型对照管加CD4抗体和CD25抗体，CD4 CD25 Foxp3加CD4抗体和CD25抗体，混匀，4℃避光孵育30min；设置无抗体的阴性对照，不含有骨髓单个核细胞，但含有实验所需的其他组分。

1.3统计学方法

2结果

2.1 ALL组与对照组STAT3 mRNA和SOCS3 mRNA的表达情况

ALL组的STAT3 mRNA表达水平显著高于对照组，SOCS3 mRNA表达水平低于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；经诱导缓解治疗后，骨髓细胞学和微小残留白血病(minimal residual disease，MRD)结果证实，45例患儿均获得完全诱导缓解，与初诊时相比较，SOCS3 mRNA表达水平明显上调(P<0.05)；缓解期患儿SOCS3 mRNA表达水平恢复正常，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

组别初诊STAT3mRNASOCS3mRNA诱导缓解期SOCS3mRNAtP对照组0.87±0.144.25±0.374.25±0.3739.430.001ALL组3.11±1.170.62±0.043.71±0.28t12.8165.911.68P0.0010.0010.06

2.2 不同危险度ALL患儿细胞SOCS3 mRNA的表达情况

将45名患儿按照初诊时危险度分为低、中、高危三组，比较三组间患儿骨髓单个核细胞SOCS3 mRNA水平，低危组均低于中危组、高危组，经比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，中危组与高危组比较SOCS3 mRNA的表达水平相似(P>0.05)，见表3。

组别SOCS3 mRNA低危组0.60±0.14中危组1.53±0.19高危组1.51±0.18t1(P1)26.35(0.001)t2(P2)30.52(0.001)t3(P3)0.51(0.84)

注：1低危组vs.中危组，2低危组vs.高危组，3中危组vs.高危组。

2.3初诊时SOCS3 mRNA高表达组与低表达组的临床特点

初诊时SOCS3 mRNA高表达组有更高的白细胞计数和乳酸脱氢酶水平，与低表达组比较差异均具有统计学意义(均P<0.05)，初诊时SOCS3 mRNA高表达组和低表达组经化疗后，诱导缓解率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

2.4 ALL患儿初诊时Treg细胞水平检测情况

ALL组患儿初诊CD4+CD25+CD127low调节性T细胞(CD4+CD25+CD127lowTreg)水平增高，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；低危、中危、高危三组ALL患儿CD4+CD25+CD127lowTreg细胞水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。

表4 初诊时SOCS3 mRNA高表达组与低表达组临床特点比较结果

注：易位性白血病/急性髓系白血病(translocation ETS leukemia/acute myeloid leukemia，TEL/AML)；B细胞抗原受体(B cell antigen receptor，BCR)；非受体酪氨酸激酶(abelson gene，ABL)；脯氨酸氧化酶(proline oxidase，POX)。

组别例数(n)CD4+CD25+CD127lowTreg(个/mL)对照组135.22±0.49ALL组458.05±1.33t12.64P0.001低危组168.96±2.20中危组207.98±1.26高危组98.40±2.11F1.63P0.72

3讨论

3.1 ALL的Janus激酶/信号转导子和激活子信号通路机制

随着白血病分子诊断学技术的不断升级和对信号转导通路的深入研究，拓展了对于白血病发病机制的了解。几乎在所有的头颈部肿瘤中都发现了STAT3异常的活化，在白血病细胞中也普遍存在着Janus激酶/信号转导子和激活子(janus kinase/signal transducer and activator，JAK-STAT)信号通路的持续激活。因此，STAT3蛋白也就成为重要的检测指标之一，在各类成人和儿童白血病中检查STAT也持续处于激活状态[3-4]。通过抑制STAT3的持续磷酸化可以抑制白血病细胞的增殖，促使其凋亡。然而到目前为止，尚未发现STAT3基因水平上的突变，故STAT3的持续活化一般都是信号分子的调节失控或者负调控分子的突变亦或缺失造成其功能的失调，其中SOCS3负性反馈调节的异常是STAT3持续表达的主要机制。

SOCS3是细胞因子信号通路转导抑制因子家族的重要成员，是负性调控JAK/STAT信号通路最重要的分子，通过调控SOCS3的表达可以达到抑制JAK/STAT信号通路上包括JAK、STAT在内的一系列细胞因子的活化水平。有研究发现，在实体瘤如肝癌、肺癌、乳腺癌中均可以检测到SOCS3表达的沉默/低表达，在血液系统肿瘤中同样发现了SOCS3的沉默/低表达，SOCS3的沉默/低表达导致STAT3通路的持续磷酸化和抗肿瘤凋亡的表达被认为是白血病的可能发病机制；在慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性髓性白血病(AML)中均发现SOCS3的低表达，导致STAT3的持续磷酸化和抗肿瘤凋亡基因高表达，最终导致白血病的发生[5-7]。本研究测定了45例新发ALL患儿初治时STAT3 mRNA表达水平，结果显示，ALL组患儿的STAT3 mRNA表达水平明显高于正常对照组，与其他同类研究结果相似，证实STAT3参与了儿童ALL的发生，儿童ALL发病过程中存在STAT3的高表达。

3.2 SOCS3与JAK/STAT信号通路的关系

在白血病中SOCS3的表达受到抑制，致使JAK/STAT信号通路的持续活化导致抗凋亡基因的激活和肿瘤细胞的增殖。本研究中发现中危、高危组ALL患儿初诊时的SOCS3表达水平均显著高于低危组，这似乎与其作用机制相矛盾，分析原因可能和SOCS3可以与SOCS家族的其他分子相互作用有关，一方面SOCS3在细胞因子白介素(IL)-6等诱导下表达上调，负反馈调控STAT3通路；另一方面SOCS3的高表达也会抑制SOCS1、SOCS2等负性调节分子的表达水平，进而引起IL-2、IL-3等细胞因子的过度表达，最终使STAT3过度活化。SOCS3与细胞因子之间的关系还有待于更加深入的研究。SOCS作为细胞因子信号转导负调控因子，与血液系统肿瘤的发生、发展、转移密切相关，SOCS表达水平与白血病的疾病状态及预后的关系也引起了关注。有对AML的研究中发现，SOCS2的表达水平高低影响着儿童AML的临床特点、诱导缓解率及长期无病生存率[8-9]。SOCS3作为SOCS家族的重要成员，参与了白血病的发生及调控，其表达水平的高低与ALL临床特点及预后的关系目前尚未见研究报道。本研究采用荧光定量PCR的方法测定了45例新发ALL患儿初诊时SOCS3表达水平，结果显示，ALL患儿的SOCS3表达水平显著低于正常组水平，而在诱导缓解期SOCS3水平较初诊时表达上调并恢复至正常水平；免疫荧光组织化学染色联合激光共聚焦显微技术实验的结果也验证了SOCS3在ALL患儿不同治疗时期的表达量不同，其证实SOCS3同样参与了儿童ALL的发生、发展，在儿童ALL中由于各种原因导致SOCS3的表达水平下调，使ALL患儿JAK/STAT3信号通路持续磷酸化和抗凋亡基因高表达，最终促进肿瘤细胞的增殖。

3.3 ALL患儿SOCS3表达与疾病临床特征的关系

本研究结果显示，SOCS3表达水平的差异与ALL的外周血细胞计数水平、乳酸脱氢酶水平、融合基因及疾病危险度相关。SOCS3高表达组有更高的外周血白细胞计数及乳酸脱氢酶水平，且预后不良基因病例更多，可能最终导致了SOCS3高表达组具有更多的中危、高危病例；而SOCS3低表达组具有更多的预后良好基因病例，致使低表达组的低危病例数更高。此外，SOCS3低表达组和TEL/AML融合基因密切相关，SOCS3低表达组的ALL患儿中TEL/AML阳性者占23.8%。在TEL-JAK2融合基因阳性的T淋巴母细胞淋巴瘤(T-cell lymphoblasticlymphoma，T-LBL)患者中存在SOCS3基因的甲基化和表达下调，通过去甲基化等手段上调SOCS3表达可以提高TEL-JAK2基因阳性的T-LBL治疗效果。通过调节SOCS3水平或许可以为TEL/AML阳性ALL患儿的治疗提供新思路。此外，通过干扰肿瘤生长和存活所依赖的信号通路可以起到治疗癌症的效果，相对于化疗而言，这种新方法能够很好地区分正常细胞和肿瘤细胞，因而能更特异地杀死肿瘤细胞，而不损伤正常细胞。有研究报道在实体肿瘤中通过基因转入或者去甲基化的手段提高SOCS3表达水平可以抑制肿瘤细胞生长和转移[10-11]。在慢性淋巴细胞白血病中通过提高SOCS3的表达同样可以抑制白血病细胞的增殖[12-13]。

3.4 ALL患儿CD4+CD25+CD127lowTreg细胞水平表达的分析

CD4+CD25+CD127lowTreg细胞是近年来发现的一种新型免疫抑制性调节细胞，其通过多种机制抑制免疫效应细胞的功能，是肿瘤免疫逃逸的关键因素。研究指出，关于CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的临床及基础研究提示，ALL细胞恶性克隆与CD4+CD25+CD127lowTreg细胞高表达导致的免疫抑制相关，白血病体内的微小病变残留主要依靠机体的自身免疫功能来清除[14]。ALL患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg细胞水平表达显著高于正常人，而在疾病治愈后CD4+CD25+CD127lowTreg细胞水平恢复正常。也有研究报道CD4+CD25+CD127lowTreg细胞水平表达与急性白血病危险度有关，在相同治疗阶段，ALL患儿中危、高危组CD4+CD25+CD127lowTreg细胞水平显著高于低危组[15]。CD4+CD25+CD127lowTreg细胞水平与儿童ALL之间的密切关系使得针对CD4+CD25+CD127lowTreg细胞进行肿瘤免疫治疗成为治疗白血病的新策略，通过控制体内CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的数量和功能有利于提高患者的抗肿瘤免疫能力及对微小病变残留的清除。

本研究中发现ALL患儿初诊时CD4+CD25+CD127lowTreg细胞水平显著高于对照组儿童，而中危、高危组患儿与低危组患儿CD4+CD25+CD127lowTreg细胞水平无明显差别，其证实了在儿童ALL中存在CD4+CD25+CD127lowTreg细胞水平的异常表达，而通过各种手段调控CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的数量和功能或许可以增强机体对白血病细胞的清除。本研究观察到在儿童ALL中，由于SOCS3的低表达致使STAT3持续活化，同时CD4+CD25+CD127lowTreg细胞水平升高，因此猜测在ALL中STAT3的持续活化可以导致CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的表达增高，进而影响机体抗肿瘤免疫，所以通过调节STAT3表达水平来调节CD4+CD25+CD127lowTreg细胞水平为肿瘤免疫和微小病变残留的清除提供了新的思路，然而具体作用机制还有待于进一步研究。

综上所述，SOCS3与儿童ALL发生、发展密切相关，SOCS3的低表达可以导致ALL中STAT3的持续活化，监测SOCS3水平可以了解疾病状态，评价危险度，SOCS3的低表达与TEL/AML融合基因的密切关系为调控SOCS3来治疗融合基因阳性的白血病提供了新的思路。SOCS3或许可以成为治疗儿童ALL的药物靶点，通过调控SOCS3的表达水平可能为儿童白血病的治疗开辟新的前景，最终实现提高儿童ALL诱导缓解率和治愈率，减少ALL的复发的目标。