高通量测序法检测奶牛乳房炎关联微生物群落结构及多样性

曾学琴，柳陈坚，杨 雪，李晓然

(昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500)

奶牛乳房炎是影响奶牛健康的主要疾病之一[1-2]，患病奶牛产奶量降低、乳品质下降，严重影响奶牛场的经济效益和人类的食品安全[3-7]。研究发现，约150多种病原体可引起奶牛乳房炎[8]，这些病原体种类较为复杂，包含细菌、病毒、真菌、支原体等。常见的导致奶牛乳房炎的病原体有20多种，以细菌最为多见，其中金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌占所有病原菌的83.74%[9-10]。导致奶牛乳房炎的病原菌可分为2种：一种是病原微生物与乳腺接触后定殖在乳腺；另一种是环境中的病原体，例如肺炎克雷伯菌、沙雷氏菌、大肠杆菌等革兰氏阴性菌[11]。研究显示，25%的细菌引起的临床乳房炎通常不能通过细菌培养检测到[12]，因此仅仅采用微生物培养的方法并不能全面地反映样品中的细菌状况，需要使用分子生物学方法进行微生物群落结构分析。

目前治疗奶牛乳房炎的主要方法是使用抗生素，但抗生素大剂量、高频率的使用不仅会导致耐药菌株的产生，而且容易造成抗生素在奶中残留，从而危害人类健康。另外，金黄色葡萄球菌的菌株能产生内毒素，在饮用了含有此毒素的奶后，会引起呕吐、发热、脱水甚至休克等症状，危害食用者健康[13]。本研究选取乳房炎奶牛乳头和牛奶进行采样，并选取健康奶牛作为对照，基于Illumina MiSeq高通量测序技术研究样品中的微生物多样性，确定引起奶牛乳房炎的主要病原菌，通过乳头擦拭样品与牛奶样品微生物组成的比较，对引起奶牛乳房炎的病原菌进行溯源，为奶牛乳房炎的控制提供前期研究基础。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Sigma3-18K离心机，美国Sigma公司；Labnet 230VEU涡旋仪，美国Labnet公司；ABI 7200 PCR仪，美国ABI公司；Nanodrop ND 1000分光光度计，美国Thermo公司。PCR Master Mix，北京TIANGEN公司；QIAquick Gel Extraction Kit，德国Qiangen公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集及预处理

到云南东南部的红河哈尼族彝族自治州泸西县牧场采集患乳房炎奶牛和正常奶牛的乳头擦拭样品和牛奶样品。擦拭样品采集时，用无菌棉签蘸少量灭菌的生理盐水后进行擦拭，并将擦拭后的棉签置于无菌管中；用无菌棉签蘸少量灭菌的生理盐水擦拭乳头后，将牛奶挤入无菌管中。共采集乳房炎奶牛的乳头擦拭样品9个(MN1-MN9)、牛奶样品5个(NM5-NM9)，正常奶牛乳头擦拭样品(HN1、HN2)和牛奶样品(NH1、NH2)各2个，共18个。将所有样品低温保存并尽快运至实验室保存于-80℃冰箱，用于后续DNA提取。

1.2.2 DNA提取和16S rRNA基因扩增及高通量测序

DNA提取参考文献[14]的方法并做适当的修改。使用细菌的16S rRNA基因V4-V5高变区通用引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和909R(5’-TTTCAGYCTTGCGRCCGTAC-3’)，在引物5’末端添加测序所需接头。PCR扩增体系中，DNA模板添加量为15 ng。扩增产物经分光光度计定量后，使用Illumina MiSeq测序系统对DNA进行测序。

1.2.3 分类信息分析

分析测序文件，去掉测序质量不好的序列，并对序列长度进行筛选，删掉长度小于400 bp的序列，得到有效的序列文件。使用Mothur Version 1.39.1软件包[15]的Miseq SOP程序进行分析，经过去除Chimera后对序列进行分类信息分析，Threshold参数为80，数据库的序列和分类信息来源为SILVA SSURef database v128[16]。

1.2.4 可操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)和系统发育树分析

按照序列相似度为97%划分OTUs，统计每个OTU的序列数目，序列比例大于10%的OTU将用于后续分析。从每个OTU中选取代表序列，将其与NCBI的GenBank数据库进行Blast比对，选取有分类信息的参考序列进行比对[17]，利用Mega 5.0[18]中的Neighbour-joining[19]构建系统进化树，Bootstrap值为1 000。对所有样品的序列数目进行均一化处理，取序列数目的对数值后，使用HemI 1.0软件绘制热图。

1.2.5 多样性指数分析

统计只有1条序列的OTU，覆盖度计算公式如下：

C=[1-(n1/N)]×100。

(1)

式(1)中，n1代表只有1条序列的OTU数，N则表示总序列数。对所有序列与数据库序列进行比对，计算所有序列之间的差异，Cutoff值为0.03。将输出的距离矩阵文件使用Cluster命令进行聚类，继而使用rarefaction.single命令分别计算各个样品的OTU数目、Chao1和ACE指数。

1.2.6 样品聚类分析

使用Thetayc算法对所有样品的序列计算距离矩阵和聚类，并进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 样品测序结果及多样性指数

通过16S rRNA基因序列测序，分析样品中的微生物群落多样性。对样品原始序列条带中低质量条带进行过滤，并进行去冗余处理，所得到的序列数及多样性指数如表1所示。奶牛乳头擦拭样品中的OTU数目和微生物多样性普遍高于牛奶样品，患病奶牛乳头擦拭样品中的OTU数目和微生物多样性高于正常奶牛，而牛奶样品中的OTU数目和微生物多样性低于正常奶牛。

样品中细菌的稀释曲线(rarefaction curve)如图1所示。稀释曲线反映了样品的取样深度，可以用来评价测序量是否足以覆盖所有类群。所有样品的稀释曲线已趋于平缓，说明样本的OTU覆盖度已基本饱和，测序数据量合理。

2.2 微生物群落的多样性分析

2.2.1 细菌门分类水平的比较

利用QIIME软件分析各样品在门分类水平上菌群的组成和结果(图2)，共得到10种细菌类群。乳头擦拭样品与牛奶样品中，优势细菌类群及其所占比例不同。乳房擦拭样品中的优势细菌类群依次是厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)，各个样品均含有这4种细菌类群，但各个细菌类群在样品中的占比差异较大。其中，样品MN1中丰度最高的细菌类群是梭杆菌门(Fusobacteria，42%)；牛奶样品中丰度最高的细菌类群是变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)；样品NM9中丰度最高的细菌类群是厚壁菌门(Firmicutes)，其次是变形菌门(Proteobacteria)；其他6个样品丰度最高的是变形菌门(Proteobacteria)，且该细菌类群在样品中所占比例极高。

表1 样品的序列信息及多样性指数

Table1Sequence information and its diversity indexs of samples

样品来源Sources样品Samples序列数Number of sequencesOTU数Number of OTUsChao1ACE覆盖度Coverage/%乳腺炎奶牛乳头MN1119706101706304097Mastitis cows nipplesMN296828081773254597MN3121138202078282996MN41765910992088295597MN54888516713495374999MN64476433355841719897MN74613015233317385299MN84376332495594700297MN94299631735354638197正常高产奶牛乳头HN1188228092216347697Nipples of normal high-yield cowHN21545513382405281196乳腺炎奶牛牛奶NM5228254571154134199Mastitis cows milkNM62814714542377283298NM7256539971905238598NM8185959802002253697NM92776215804155316197正常高产奶牛牛奶NH12522720973792455396Milk of normal high-yielding cowNH2307834561034112399

图1 相似度为97%条件下各样本的稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves of each sample at cutoff level of 3%

2.2.2 细菌科分类水平的比较

利用QIIME软件分析各样品在科分类水平上菌群的组成和结果(图3)。研究发现，不同样品来源间细菌类群差异较大。乳房炎擦拭样品均含有且丰度较高的是Moraxellaceae、Ruminococcaceae、Xanthomonadaceae、Staphylococcaceae，不同症状的各个样品之间细菌类群的组成和比例明显不同。样品MN1细菌组成与其他样品差异最大，优势细菌类群有Fusobacteriaceae、Leptotrichiaceae、Bacteroidaceae；MN2、MN3、MN4细菌类群多样性丰富，组成大致相同；MN5、MN6、MN7、MN8、MN9细菌组成大致相同。2个正常高产奶牛擦拭样品中优势细菌类群不同，HN1主要是Moraxellaceae(24%)，HN2主要是Ruminococcaceae(19%)。牛奶样品中丰度最高的是Pseudomonadaceae，尤其在样品NH2中高达88%，但样品NM9中丰度最高的是Enterococcaceae(24%)。

图2 细菌门分类水平的比较Fig.2 Comparison of bacteria groups at phylum level

图3 细菌科分类水平的比较Fig.3 Comparison of bacteria groups at family level

2.2.3 细菌属分类水平的比较

利用QIIME软件分析各样品在属分类水平上菌群的组成和结果(图4、图5)，乳房擦拭样品与牛奶样品明显不同，乳房擦拭样品不同症状的各个样品之间差异较大。乳房擦拭样品除MN1外均检测到且比例较高的属为Acinetobacter，样品MN1中比例较高的是Fusobacterium(29%)和Caviibacter(13%)。牛奶样品除NM9外，丰度最高的是Pseudomonas(55%)，其次是Pseudomonadaceae_unclassified(16%)。此外，样品NM9检测到了较大比例的Enterococcus(33%)，且该属仅在NM9中被检测到。

2.3 OTU数及系统发育分析

将丰度较高的14个OTU序列抽提出来，在NCBI的GenBank进行Blast比对，下载最相近的序列构建系统发育树(图6)，将14个OTU在样品中的数目均一化后取对数值绘制热图(图7)。

图4 乳房擦拭样品细菌属分类水平的比较Fig.4 Comparison of bacteria groups at family level of breast wipe samples

图5 牛奶样品细菌属分类水平的比较Fig.5 Comparison of bacteria groups at genus level of milk samples

图6 聚类分析图Fig.6 Cluster analysis diagram

图7 热图Fig.7 Heat map

乳房擦拭样品和牛奶样品中的主要OTU存在在较大差异。所有乳房擦拭样品均含有OTU00017，被鉴定为Pseudomonasstutzeri。MN1丰度最高的是OTU00014，与Fusobacteriumnecrophorum相似度极高。MN2丰度最高的是OTU00011，与Janibacter属中的Janibactercremeusstrain RSB8一致。MN3、MN5、MN6、MN8、MN9、HN1丰度最高的均为OTU00002，属于Acinetobacter，与Acinetobactersp.993B6_12ER2A序列最为接近。MN4最高的是OTU00016，与Atopostipessp.strain ZH16相似；其次是OTU00011。MN7最高的是OTU00006，其属于Fusobacteria。HN2最高的是OTU00004，被鉴定为Achromobacterxylosoxidans。NM5、NM6、NM7、NM8、NH1、NH2丰度最高的均为OTU00001，OTU00001属于Pseudomonas，与Pseudomonassp. ps1-11的序列极为相似。NM9丰度最高的则为OTU00003，OTU00003与Vagococcussp. 176B7_12Agalle相似；其次是OTU00005，其与Jeotgalibacadankookensisstrain HM序列相似。OTU00008存在于所有样品中，被鉴定为Corynebacteriumfaecale。最值得注意的是，OTU00020存在于所有乳房炎奶牛的样品中，该OTU被鉴定为Staphylococcusaureus。

2.4 聚类分析

对18个样品进行聚类分析(图8)。乳头擦拭样品和牛奶样品的微生物明显分开，乳房炎奶牛的乳头擦拭样品除MN1外都聚在一起，正常奶牛的乳头擦拭样品聚在一起，乳房炎奶牛的牛奶样品除NM9外都聚在一起，正常奶牛的牛奶样品聚在一起。

图8 基于Thetayc算法的聚类分析Fig.8 Cluster analysis based on Thetayc calculator

3 讨论

奶牛患乳房炎不仅会造成重大经济损失，还会危害人类健康。本研究使用基于16S rRNA基因的高通量测序技术对患乳房炎奶牛和正常奶牛的乳头擦拭样品、牛奶样品的微生物多样性进行分析，探索奶牛患乳房炎后乳房表面和乳房内微生物组成和变化。

Catozzi等[20]的研究表明，乳房炎奶牛牛奶样品中主要存在厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)，与本研究的结果不完全一致。已有研究发现，梭杆菌(Fusobacteria)在结肠癌细胞中生长旺盛，并且与结肠炎相关[21-22]；Swidsinski等[23]的研究认为，梭杆菌门(Fusobacteria)中的各种梭菌都与急性阑尾炎有关。本研究结果显示，在症状严重的3个样品中，梭杆菌门(Fusobacteria)丰度较高，表明其与奶牛乳房炎的发生密切相关。

莫拉氏菌科(Moraxellaceae)主要包括莫拉克斯氏菌属(Moraxella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)及相关生物体。其中，不动杆菌(Acinetobacter)是条件致病菌，在自然界分布广泛(如水、土壤、蔬菜等)[24]。本研究中，莫拉氏菌科(Moraxellaceae)细菌在患病奶牛样品中的丰度普遍高于正常奶牛，不动杆菌丰度变化趋势与莫拉氏菌科丰度变化一致，说明主要是不动杆菌发挥作用。在牧场中，来自于自然界的不动杆菌容易在奶牛潮湿的乳房部位形成菌群，造成乳房感染后引发乳房炎，不动杆菌可能是造成乳房炎的外源病原菌。假单胞菌科(Pseudomonadaceae)中的假单胞菌(Pseudomonas)是机会致病菌，与坏死病变有关[25-26]。挤奶易造成奶牛乳房机械性损伤，假单胞菌属丰度的改变存在两种可能：一种是奶牛患乳房炎后免疫力下降、接受抗生素治疗引起假单胞菌属感染；另一种可能是自然界中的假单胞菌通过乳头进入乳房并定植于乳房内，使得乳房内假单胞菌含量升高，定植于乳房内的假单胞菌引起奶牛乳房炎。假单胞菌可能是造成乳房炎的内源致病菌。葡萄球菌科(Staphylococcaceae)中的葡萄球菌(Staphylococcus)多为致病菌，本项研究中，病牛乳头擦拭样品中均含有葡萄球菌，且患病奶牛中的含量明显高于正常奶牛。

各个样品中的主要OTU存在较大差异。所有擦拭样品中都含有金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，OTU00020)，金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎病例中经常分离到的病原体[27]。MN3、MN5、MN6、MN8、MN9中分离的主要是不动杆菌属(Acinetobactersp.，OTU00002)，不动杆菌属的细菌多为条件致病菌[24]。MN1中丰度最高的是坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum，OTU00014)，坏死梭杆菌属于梭菌属，梭菌属细菌与多种疾病的发生具有相关性[21-23]，且坏死梭杆菌是多种坏死病的主要或次要病原菌[28]。牛奶样品中主要含有假单胞菌属(Pseudomonassp.，OTU00001)细菌，假单胞菌属是机会致病菌，但其在正常牛奶样品中也大量存在，与乳腺炎的相关性还需扩大样本量进一步研究。

综上所述，奶牛乳房表面与牛奶中的微生物差异极大，牛奶中的微生物更能代表整个乳房的微生物组成，奶牛患乳房炎后乳房表面和乳房内微生物组成都会发生变化，外源病原菌和内源病原菌都可能引起乳房炎。