气道上皮hCLCA1与肺内源性ARDS炎症及预后相关性的初步研究

张天相 梁家宁 杨揆 郑龙 陈伟 张艳 宋立强

空军军医大学西京医院呼吸与危重症医学科,西安710032

肺内源性急性呼吸窘迫综合征(pulmonary acute respiratory distress syndrome,ARDSp)是ARDS的最常见临床类型,是指由直接影响肺实质的病变如肺炎、淹溺、毒气、肺挫伤等诱发的ARDS,其中最常见的病因是感染[1]。目前认为发病机制是感染相关启动因子诱导以中性粒细胞为主的炎症细胞在肺内大量积聚、浸润,过度释放、活化炎症因子,而抗炎因子相对减少,引发肺部炎症反应失衡[2]。其中支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中中性粒细胞百分比和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平是反映炎症程度的常用监测指标[3-4]。但ARDSp病死率仍居高不下的主要原因是炎症的启动机制仍未能完全阐明。

气道上皮细胞是呼吸系统的第一道物理屏障,也是具有生物学活性的免疫屏障,对外界刺激能迅速做出功能性反应甚或结构性改变。近年研究发现气道杯状细胞分泌的人钙激活氯离子通道1(human calcium-activated chloride channel 1,hCLCA1)蛋白与COPD、支气管哮喘等气道疾病的黏液高分泌及炎症机制紧密相关[5-6]。但是气道上皮杯状细胞及h CLCA1在ARDSp发病机制中扮演怎样的角色仍不清楚。基于此,本观察性临床研究拟探讨h CLCA1表达水平与ARDSp患者肺部炎症水平、临床预后的相关性,试图找到hCLCA1在ARDSp病理生理中发生变化的线索。

1 对象与方法

1.1研究对象 2017年1月至2018年6月空军军医大学西京医院呼吸内科门诊及病房需要行支气管镜检查的患者作为研究筛选对象,根据纳入标准分别收入ARDSp组、社区性获得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)组及正常对照组。研究方案得到医院医学伦理委员会批准,检测标本得到入选患者的知情同意。

1.1.1ARDSp组纳入标准 (1)入住呼吸重症监护室并且未超过48 h；(2)符合ARDS柏林指南诊断标准[7],病因系CAP；(3)排除COPD、哮喘、支气管扩张等慢性气道基础疾病、血液疾病及长期吸烟史,近1周无使用全身皮质激素史；(4)临床诊疗过程已经决定拟行支气管镜检查及灌洗获取下呼吸道标本；(5)年龄≥18岁；(6)根据临床特征排除单纯性重症CAP[8]。

1.1.2CAP组纳入标准 (1)已经预约气管镜检查的门诊患者；(2)符合《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)》诊断标准[9]；(3)病程未超过1周；(4)排除COPD、哮喘、支气管扩张等慢性气道基础疾病、血液疾病及长期吸烟史,近1周无使用全身皮质激素史；(5)年龄≥18岁；(6)未达到重症肺炎诊断标准。

1.1.3正常对照组纳入标准 (1)已经预约气管镜检查的门诊患者；(2)临床诊断为孤立性肺部结节或包块性质待查；(3)排除COPD、哮喘、支气管扩张等慢性气道基础疾病、血液疾病及长期吸烟史,近1周无使用全身皮质激素史；(4)年龄≥18岁；(5)同意在正常肺叶获取BALF。

1.2方法

1.2.1BALF标本采集 根据ARDSp组和CAP组患者的影像学渗出性病灶、正常对照组患者的正常肺叶确定灌洗的靶位。经支气管镜工作通道注入37℃无菌生理盐水20 ml。注入完成后,抽吸灌洗液,回收率40%～60%为合格,经双层纱布过滤,收集至无菌容器置于含冰块的保温箱里,立即送往实验室检查。

1.2.2BALF细胞计数 在4℃、1 200 r/min、离心半径8.4 cm条件下离心10 min,上清液放置于-80℃冰箱保存备用。沉淀的细胞用Hank's液(不含Ca2+、Ma2+)再离心冲洗2次,每次5 min。弃去上清后加Hank's液3～5 ml制成细胞悬液。在Neubauer计数台上计数BALF中细胞总数。如果细胞数过高时,再用Hank's液稀释,调整细胞数为5×109/L,并同时将试管浸入碎冰块中备用。计数方法：采用细胞离心涂片装置,加入备用细胞悬液(细胞浓度为5×109/L)100μl,在4℃、1 200 r/min、离心半径8.4 cm条件下离心1 min,通过离心作用将一定数量的BALF细胞直接平铺于载玻片上。取下载玻片立即用冷风吹干,置于无水乙醇中固定30 min后进行瑞吉式染色。在40倍光学显微镜下计数200个细胞,进行细胞分类计数并计算中性粒细胞占细胞总数百分比。

1.2.3BALF蛋白含量检测 取上述离心后获取的BALF上清液,常温下解冻,使用多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司),采用酶联免疫吸附试验法检测TNF-α(由武汉博士德公司提供)及hCLCA1(由英国Abcam公司提供)水平。具体操作步骤如下：(1)从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需板条；(2)设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品100μl；(3)样本孔先加待测样本10μl,再加样本稀释液40μl,空白孔不加；(4)除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μl,用封板膜封住反应孔,37℃恒温箱温育90 min；(5)弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1 min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复5次；(6)每孔加入底物A、B各50μl,37℃避光孵育15 min；(7)每孔加入终止液50μl,在450 nm波长处测定各孔的OD值。以标准品的吸光度值绘制标准曲线,推导回归方程,计算各组BALF中hCLCA1、TNF-α的水平。

1.3统计学分析 应用SPSS 17.0统计学软件进行统计学处理。计量资料以±s表示,处理组间分析采用配对t检验。指标间的相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义,P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1一般资料 ARDSp组26例,其中男15例,女11例,年龄(59.3±6.7)岁。以28 d内是否死亡为标准分为2个亚组：生存组14例,其中男8例,女6例,年龄(57.2±7.8)岁；死亡组12例,其中男7例,女5例,年龄(61.2±3.2)岁。生存组和死亡组的入院基线临床指标分别是氧合指数[(142.5±20.1)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)、(133.6±15.5)mm Hg]、APACHEⅡ评分[(17.3±3.1)分、 (18.4±7.2)分]、SOFA评分[(6.5±1.4)分、(7.2±2.5)分],组间比较差异无统计学意义。CAP组26例,其中男16例,女10例,年龄(53.84±14.60)岁。正常对照组28例,其中男16例,女12例,年龄(50.03±15.3)岁。3组性别、年龄差异无统计学意义,基础情况具有均衡性。

2.2各组BALF中h CLCA1、TNF-α水平及中性粒细胞百分比的比较 与正常对照组比较,ARDSp组、CAP组BALF中hCLCA1、TNF-α、中性粒细胞百分比均显著升高(P值均＜0.01)。ARDSp组BALF中hCLCA1、TNF-α、中性粒细胞百分比高于CAP组(P＜0.05或P＜0.01)。见表1。

表1 3组患者BALF中hCLCA1、TNF-α水平及中性粒细胞百分比的比较(±s)

表1 3组患者BALF中hCLCA1、TNF-α水平及中性粒细胞百分比的比较(±s)

注：BALF为支气管肺泡灌洗液；hCLCA1为人钙激活氯离子通道1；TNF-α为肿瘤坏死因子α；CAP为社区性获得性肺炎；ARDSp为肺内源性急性呼吸窘迫综合征；与正常对照组比较,a P＜0.01；与CAP组比较,b P＜0.05,c P＜0.01

组别 例数 hCLCA1(ng/L)TNF-α(ng/L)中性粒细胞百分比(%)正常对照组 28 5.03±1.55 5.52±1.64 1.32±0.98 CAP组 26 22.35±11.85a 52.58±28.81a 43.25±16.15a ARDSp组 26 50.01±20.72ab 80.73±25.91ab 74.37±10.13ac

2.3不同预后ARDSp患者治疗前后BALF中hCLCA1、TNF-α及中性粒细胞百分比的比较 治疗前,ARDSp死亡组BALF中hCLCA1、TNF-α均高于生存组(P值分别为0.035、＜0.01),2组BALF中中性粒细胞百分比差异无统计学意义。

与治疗前比较,ARDSp死亡组BALF中hCLCA1、TNF-α、中性粒细胞百分比在治疗7 d后差异无统计学意义,ARDSp生存组BALF中hCLCA1、TNF-α、中性粒细胞百分比在治疗7 d后下降(P值均＜0.05)。见表2。

表2 不同预后ARDSp患者治疗前后BALF中hCLCA1、TNF-α及中性粒细胞百分比的比较(±s)

表2 不同预后ARDSp患者治疗前后BALF中hCLCA1、TNF-α及中性粒细胞百分比的比较(±s)

注：ARDSp为肺内源性急性呼吸窘迫综合征；BALF为支气管肺泡灌洗液；hCLCA1为人钙激活氯离子通道1；TNF-α为肿瘤坏死因子α

组别 例数 hCLCA1(ng/L)TNF-α(ng/L)中性粒细胞百分比(%)治疗前 治疗7 d后 P值治疗前 治疗7 d后 P值治疗前 治疗7 d后 P值生存组 14 38.12±16.27 27.05±12.75 0.043 60.82±18.47 44.79±18.70 0.034 72.64±6.89 64.35±11.92 0.039死亡组 12 52.29±17.46 63.79±12.45 0.081 96.33±21.17 106.91±12.09 0.150 76.38±12.61 72.91±17.68 0.610 P值 0.035 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.490 0.170

2.4ARDSp患者BALF中各项指标的相关性直线相关分析显示,ARDSp患者BALF中hCLCA1与TNF-α呈正相关(r=0.823,P＜0.05),BALF中中性粒细胞百分比与TNF-α呈正相关(r=0.417,P＜0.05),同时与hCLCA1也呈正相关(r=0.430,P＜0.05)。

3 讨论

全身及肺部炎症风暴目前仍被公认为是ADRS的主要发病机制。包括肺炎在内的多种肺内外病因能诱发过度活化的炎症反应发生,其中肺内中性粒细胞、肺泡巨噬细胞等炎症细胞的激活以及大量炎性介质、细胞因子的释放被认为是ARDS的特征性炎症标志。但是这种炎症风暴的始动机制仍不清楚,以至于在ARDS发生后临床只能被动地给予支持对症处理,而且针对炎症本身采取的糖皮质激素、一氧化氮、西维来司他、他汀等治疗方案在临床研究中均未能获得预期疗效,“积极等待”炎症水平回落成为临床的无奈事实。

炎症细胞数量及炎症介质水平仍然是临床评判炎症程度的直接指标。TNF-α作为促炎分子之一,其可以促进中性粒细胞的吞噬能力,促进中性粒细胞脱颗粒和释放溶酶体,增强中性粒细胞呼吸暴发,产生大量脂质代谢产物,引起微血管舒缩异常和微血栓形成,加速ARDS的发展进程。Kim等[10]研究认为ARDS患者气道中中性粒细胞的水平与疾病严重程度呈正相关,在气道炎症中发挥着重要作用。另有研究认为,TNF-α是ARDS发生炎症介质“瀑布”样反应的始动因子,可以刺激其他细胞因子和炎症因子的生成和释放,形成逐级放大的连锁反应,进一步损伤血管内皮细胞,增加其通透性,导致白细胞黏附、中性粒细胞脱颗粒并趋化到炎症损伤部位,加重肺部损伤,在ARDS的发生中发挥着极为重要的作用[11]。本课题组曾使用内毒素诱导建立ARDS小鼠模型,得出ARDS小鼠BALF中TNF-α含量明显高于正常小鼠的结果[12]。然而针对TNF-α的单抗没能在临床研究中改善预后,可见复杂的炎症网络机制在ARDS发生中共同发挥着作用。此外,Abraham等[13]提出BALF中中性粒细胞百分比可以很直观反映急性肺损伤的严重程度的观点,验证了肺损伤程度与肺泡内中性粒细胞的数量呈正相关。本研究结果发现ARDSp患者BALF中的TNF-α水平均明显高于CAP患者及正常对照组；ARDSp生存组TNF-α水平低于死亡组,同时治疗7 d后该组的TNF-α水平较治疗前下降。提示了TNF-α是肺组织炎症水平的重要标识因子之一。此研究中ARDSp患者BALF中中性粒细胞百分比与TNF-α呈正相关,ARDSp生存组在治疗7 d后BALF中中性粒细胞百分比也较治疗前下降,此结果再一次验证了TNF-α及中性粒细胞在ARDSp严重程度评价中的意义。

气道上皮细胞是否参与ARDS肺部炎症风暴的形成仍不清楚。防治ARDS的关键环节仍然是阐明其炎症的始动机制,位于气道第一屏障的上皮细胞是否在ARDSp发生中扮演一定的始动作用呢?本研究拟初步探讨既往未知的气道上皮杯状细胞及相关蛋白在ARDSp发生、发展中的角色。气道杯状细胞特有的hCLCA1最初被认为是一种跨膜蛋白,目前确认hCLCA1是分泌型蛋白,裂解的N端肽段对上皮细胞Cl-通道具有调节作用,能调控黏液蛋白的合成[14],其与气道慢性炎症(包括哮喘、COPD和肺囊性纤维化等)的发生与程度密切相关[15-19]。有研究表明,hCLCA1与肺部感染性炎症的形成相关。如Hauber等[20]使用内毒素可以直接诱导培养人气道黏液细胞分泌hCLCA1。2014年Dietert等[21]报道mCLCA3-/-小鼠金黄色葡萄球菌肺炎模型BALF中趋化因子CXCL1及IL-17减少,并降低了肺部中性粒细胞的浸润程度。以上结果初步证实了气道上皮合成的CLCA参与了肺部感染性炎症的形成并可能扮演促进作用,而其与ARDS之间的关系正是本研究设计时关注的要点。本研究结果显示ARDSp患者BALF中的hCLCA1高于CAP患者及正常对照组。ARDSp死亡组BALF中hCLCA1高于生存组,经过治疗未能下降,而生存组则有所降低。通过直线相关性分析得出hCLCA1与TNF-α水平呈正相关,这种相关性提示两者在ARDSp病理生理改变中可能存在一定因果关系。

总之,本研究以ARDSp为主要目标人群,以BALF中hCLCA1水平为主要目标指标,通过对ARDSp、CAP及正常肺叶人群BALF中hCLCA1、TNF-α水平及中性粒细胞百分比的变化、相关性以及与预后转归的关系分析,初步提示气道上皮hCLCA1与ARDSp的肺组织炎症水平及预后可能存在一定正相关性,推测CLCA可能对ARDS炎症机制具有促进作用,需要在动物及细胞实验中进一步证实。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突