黑节铁皮石斛组织培养技术研究

封海东 金善忠 张斌 周明 张泽志 赵志全 郭锐

摘要：对黑节铁皮石斛茎尖原球茎诱导和茎尖增殖以及小苗生根进行了初步研究。采用黑节铁皮石斛无菌苗茎尖，经过75%乙醇消毒30 s后，去除表皮，黑节铁皮石斛带节茎尖原球茎诱导与茎尖增殖最佳培养基为1/2MS+5.5 g/L琼脂+0.55 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L土豆泥+20 g/L白砂糖+0.45 g/L活性炭。黑節铁皮石斛生根最佳培养基为1/2MS+5.5g/L琼脂+0.15 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L香蕉泥+20 g/L白砂糖+0.25 g/L活性炭。

关键词：黑节铁皮石斛;茎尖;原球茎;增殖;生根

中图分类号：Q813.1         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）16-0139-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.032           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： The protocorm induction and proliferation as well as seedling rooting of Dendrobium candidum Wall. ex Lindl. cv. Heijie stem tip were studied preliminarily. Dendrobium candidum Wall. ex Lindl. cv. Heijie stem tip was sterilized with 75% alcohol for 30 s， and then the epidermis was removed. The best protocorm induction and proliferation medium of Dendrobium candidum Wall. exLindl. cv. Heijie stem tip was 1/2 MS+5.5 g/L agar+0.55 mg/L 6-Benzylaminopurine+0.55 mg/L 1-Naphthalenea acid+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L mashed potato+20 g/L white granulated sugar+0.45 g/L activated carbon. The best rooting medium of Dendrobium candidum Wall. exLindl. cv. Heijie seedling was 1/2 MS+5.5 g/L agar+0.15 mg/L 6-Benzylaminopurine+0.55 mg/L 1-Naphthalenea acid+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L banana puree+20 g/L white granulated sugar+0.25 g/L activated carbon.

Key words： Dendrobium candidum Wall. Ex Lindl. cv. Heijie; stem tip; protocorm; proliferation; rooting

铁皮石斛（Dendrobium candidum Wall. Ex Lindl. cv. Heijie）为兰科石斛属多年生草本药用植物，是一种传统名贵中药材，始载于《神农草经》，具有滋阴清热、益胃生津、提高免疫力、抗癌防癌等作用。铁皮石斛种子必须在适宜的环境与真菌共生才能萌发，且种子与茎段扦插繁殖成本高、用量大、周期长，难以形成规模化。组织培养技术是实现快速繁殖、规模化生产的最佳方法。

近年来，相关研究学者开展了大量的铁皮石斛原球茎诱导、丛生芽增殖和生根组织培养快繁技术研究。苏钛等[1]研究表明，以茎段为外植体在培养基MS+2.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA+马铃薯汁10%+白砂糖3%，具有很好的原球茎诱导作用，50 d后诱导率达95.20%。戴传云等[2]用正交试验筛选出铁皮石斛原球茎增殖的最佳培养基为1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L KT。张桂芳等[3]认为一定浓度的BA、KT和NAA有利于原球茎的增殖，KT浓度为1.0 mg/L时，原球茎40 d增殖倍数最高，达9.0。郭洪波等[4]通过无菌茎段实现铁皮石斛快速繁殖，且外植体在MS+5.0 mg/L 6-BA+NAA（0～0.8 mg/L）上诱导丛生芽最好，诱导率高达93.33%，增殖培养基为MS+5.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+20%香蕉泥。陈兆贵等[5]也表明，1/2MS+2.0 mg/L IBA+水解酪蛋白500 mg/L+10%香蕉提取液的培养基上效果较好，45 d生根率达92%。不同培养基、生长调节剂的使用，对不同外植体原球茎诱导、丛生芽、生根有不同影响。如，王春等[6]用铁皮石斛的茎尖作为外植体，接种1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培养基上诱导产生原球茎，诱导率为58%。常美花等[7]研究结果表明，铁皮石斛带芽茎段原球茎诱导的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2.0 g/L琼脂;而不加生长调节剂的MS培养基铁皮石斛的原球茎诱导率为0。

另外，组织培养技术的应用，导致铁皮石斛引种、野转家栽培、组培苗人工栽发生混乱，同一产区的铁皮石斛品种繁多，同一铁皮石斛品种的品质也存在较大差异[8]。十堰地区铁皮石斛品种较多，但少有利用组织培养技术工厂化生产铁皮石斛，多采用野转家、引种的方式进行人工栽培，导致十堰地区铁皮石斛规模化生产成本高、投入大。黑节铁皮石斛，又称红秆软脚铁皮石斛，是由野生铁皮石斛培育的新品种，药效成分优于野生铁皮石斛[9]，又易制成枫斗，从而引起人们的关注。鉴于此，以黑节铁皮石斛茎尖为材料，对其丛生芽诱导和生根进行了初步研究，以期为十堰地区黑节铁皮石斛的人工繁殖技术研究作铺垫。

1  材料与方法

1.1  材料

试验材料：黑节铁皮石斛茎尖来源于丹江口市盐池河中药材专业合作社提供。

设备：诸城鼎力机械有限公司全自动高压杀菌锅（制造许可证编号TS2237502-2016，设备代码217037502201）;KC-280灌装机控制器（温州市凯驰包装机械有限公司）;SW-CJ-ID单人净化工作台（苏州净化设备有限公司）。

试剂：以1/2MS为基本培养基，生长调节剂选用6-BA（6-benzylaminopurine）和NAA（1-naphthlcetic acid），外源添加物为土豆泥（去皮、切块，加水煮烂，过滤，取滤汁）、香蕉泥、琼脂粉（福建省石狮市高新琼脂食品有限公司闽南琼胶有限公司），pH为5.5～5.7。

1.2  方法

1.2.1  培养基的配制  原球茎诱导培养基：①1/2MS+5.5 g/L琼脂+0.55 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L土豆泥+20 g/L白砂糖+0.45 g/L活性炭;②MS+2 mg/L 2，4-D+30 g/L白砂糖;丛生芽诱导培养基：①1/2MS+5.5 g/L琼脂+0.55 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L土豆泥+20 g/L白砂糖+0.45 g/L活性炭;②1/2MS+5.5 g/L琼脂+0.55 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+100 g/L土豆泥+20 g/L白砂糖+0.45 g/L活性炭;生根培养基：1/2MS+5.5 g/L琼脂+0.15 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L香蕉泥+20 g/L白砂糖+0.25 g/L活性炭。上述培养基配置好后，分别装入培养瓶中，重复次数50瓶。置于高压杀菌锅中灭菌30 min（121 ℃，0.1 MPa）。放入培养室2 d，在没有细菌和真菌污染的培养瓶内接种黑节铁皮石斛。

1.2.2  茎段选取与处理  从丹江口市盐池河中药材专业合作社简易大棚种植基地采取生长旺盛黑节铁皮石斛植株，用洗洁精清洗15 min，再用自来水反复冲洗数次，擦干备用。将组培苗瓶子外部用75%乙醇擦拭干净后，置于净化工作台上，备用。

2017年10月对黑节铁皮石斛进行不同的处理（第一种：75%乙醇对大棚种植的黑节铁皮石斛消毒30 s;第二种：75%乙醇对无菌组培的黑节铁皮石斛消毒30 s;第三种：对无菌组培的黑节铁皮石斛不消毒）后，留取幼嫩茎尖，并剪成带节间的长2.0 cm的茎段，丛生芽诱导培养基内培育30 d。2018年6月，对黑节铁皮石斛无菌苗茎段进行原球茎、丛生芽、生根诱导。

1.2.3  培养条件  将接种后的培养瓶均放入光照培养室中培养，温度为（25±2） ℃，光照10 h/d，光照度为1 500～2 000 lx，湿度为60%～70%。每天观察黑节铁皮石斛带芽茎段在培养基中的生长情况，筛选出原球茎与丛生芽诱导最佳培养方式。

2  结果与分析

2.1  黑节铁皮石斛带节茎段消毒方法的筛选

由表1可知，黑节铁皮石斛带节茎尖仅用75%乙醇消毒处理1 min后，污染率较高。而组培无菌苗经过70%乙醇消毒处理1 min后，污染率较低（表1）。这与李丹等[9]研究结果一致。因此，进行铁皮石斛组培时，采用无菌苗进行，或用75%乙醇消毒有菌苗后，再用0.1%HgCl2处理茎段20 min。

2.2  黑节铁皮石斛茎尖的原球茎诱导

常美花等[7]通过MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2 g/L琼脂诱导铁皮石斛茎段，诱导率达到34.98%。苏钛等[1]的研究也表明，铁皮石斛茎段在培养基MS+2.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA+马铃薯汁10%+3%白砂糖上，原球茎诱导率达95.20%。本研究通过无菌铁皮石斛茎尖进行快速繁殖，发现1/2MS+5.5 g/L琼脂+0.55 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L土豆泥+20 g/L白砂糖+0.45 g/L活性炭，具有较好的原球茎诱导作用，速度快、效果好（表2、图1）。这说明由于铁皮石斛原球茎在MS培养基上，采用一定浓度的6-BA和NAA均能夠有效促进铁皮石斛茎尖的原球茎诱导。

2.3  黑节铁皮石斛茎尖增殖

增殖是铁皮石斛腋芽生长与地上生物量增加较多的过程。王春等[6]研究发现，培养基1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA能够较好诱导铁皮石斛不定芽生长。而本试验结果显示，在相同培养基条件下，6-BA和NAA浓度的不同，对黑节铁皮石斛茎尖增殖有明显的差异，且NAA的用量直接影响小苗增殖效果（表3、 图2）。邓瑞云等[10]通过不同NAA浓度的培养基发现，0.5 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA导致铁皮石斛小苗矮粗，发生变异现象。这可能是培养基中生长调节剂浓度的不平衡，导致铁皮石斛生长随着生长调节剂浓度的变化，而有一定的趋向性。

2.4  黑节铁皮石斛小苗生根的培养

挑选3 cm高的小苗接种于生根培养基中60 d后，培养基1/2MS+5.5 g/L琼脂+0.15 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L香蕉泥+20 g/L白砂糖+0.25 g/L活性炭，能够有效促进铁皮石斛小苗生根（图3）。这与邓瑞云等[10]研究发现，不同浓度的NAA培养基对铁皮石斛小苗生根无显著影响，而香蕉泥对铁皮石斛根系有明显的促进作用结果一致。

3  讨论

随着人们生活改善及医疗保健意识提高，铁皮石斛的需求持续增加，野生资源已经不能满足需求，产业化生产是解决供求矛盾的良好途径。实施产业化的人工栽培首要任务就是解决种源的问题，但铁皮石斛的自然繁殖率低，仅仅依靠自然繁殖无法满足产业化的需求，因此科学繁育种苗是发展的必然选择。本研究使用黑节铁皮石斛无菌苗进行快速繁殖，缩短了组培育苗的时间，且小苗质量较好。在组织培养中，原球茎及外植体的增殖与外源植物生长调节剂的作用密不可分，其中适当浓度配比的6-BA和NAA尤为重要。在铁皮石斛生根培养上，香蕉汁对根系有一定的促进作用。

参考文献：

[1] 苏  钛，张晓南.液体悬浮培养促进铁皮石斛原球茎高效诱导、增殖的研究[J].中国野生植物资源，2009，28（4）：54-56.

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[4] 郭洪波，于晓丹，陈丽静，等.铁皮石斛茎节离体培养的研究[J].时珍国医国药，2007（11）：2659-2660.

[5] 陈兆贵，谭  俊.不同激素配比对铁皮石斛组织培养的影响研究[J].惠州学院学报（自然科学版），2006（3）：11-14.

[6] 王  春，郑勇平，罗  蔓，等.铁皮石斛试管苗快繁体系[J].浙江林学院学报，2007（3）：372-376.

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[10] 邓瑞云，罗焕明，刘晓津，等.铁皮石斛组培快繁技术研究[J].广东药学院学报，2013，29（6）：608-611.