上海春季大气颗粒物中致敏悬铃木花粉蛋白的分布特征

2019-09-20彭加仙张红莉王伟倩王青躍谭正莹周树敏吕森林

上海大学学报（自然科学版） 2019年4期

赵慧, 彭加仙, 洪强, 张红莉, 王伟倩, 王青躍,谭正莹, 周树敏, 张卫, 吕森林

(1. 上海大学环境与化学工程学院, 上海200444; 2. 上海大学生命科学学院, 上海200444;3. 日本埼玉大学大学院理工学研究科, 埼玉338-8570)

近年来, 随着城市绿化面积的增加和植物种类的增多, 人群中花粉过敏的就诊率也在逐年递增. 花粉症的发病率升高, 已成为全球性的问题. 在国内, 花粉症患者在人群中的发病率约为0.5%～1.0%, 最高的发病地区可达5%[1]. 研究表明, 花粉是诱发季节性过敏性鼻炎和哮喘的主要原因[2]. 在外部因素的作用下, 花粉内部的细颗粒物(subpollen particles, SPPs)会被释放出来[3], 长期悬浮在环境中, 成为PM2.5的一部分, 对人群健康产生影响. 资料显示, 悬铃木属植物花粉是我国主要的致敏花粉[4], 其致敏蛋白主要包括Pla a1, Pla a2 和Pla a3, 其中Pla a3 属于非特异性的糖蛋白脂质转移蛋白[5-7]. 作为城市道路景观树, 悬铃木在上海市分布广泛, 其花粉已经成为上海市春季主要的致敏原[8-9]. 本工作选择上海大气颗粒物中致敏悬铃木花粉蛋白Pla a3 为研究对象, 利用生物工程手段表达Pla a3 蛋白, 并使用该致敏蛋白免疫大鼠, 获取单一致敏原的抗体, 利用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 检测分析上海市大气颗粒物中Pla a3 蛋白的分布特征. 这一研究工作不仅可以为今后进一步制备单抗及基因工程生产花粉变应原奠定基础, 提高过敏性哮喘病的诊治水平, 还可以为上海城镇绿化植物的合理选择和配置提供重要的参考依据.

1 材料与方法

1.1 大气颗粒物采集

本工作采集了上海2017 年春季的大气颗粒物, 使用日本柴田公司SIBATA 五级大流量采样器采集大气颗粒物. 采集前, 将石英膜在马弗炉(450◦C)中焙烧4 h, 在恒温恒湿箱中以25◦C 温度和50%湿度条件放置24 h, 用电子天平准确称重, 然后用干净的铝箔纸包裹, 放置在-4◦C 的冰箱中保存[10]. 采样地点在上海大学宝山校区南门, 采样高度为1.5 m, 每次采样周期为48 h. 采样器能将大气中的颗粒物根据空气动力学直径分别采集到5 张石英滤膜上, 工作流速为566 L/min, 五级的切割粒径分别为＞7.0, 3.3～7.0, 2.0～3.3, 1.1～2.0, ＜1.1µm. 采样结束后, 滤膜用铝箔纸包裹好, 恒温恒湿24 h 后称重, 然后密封包装于-20◦C 的冰箱中冷冻保存, 以待分析测试.

1.2 抗体制备

克隆悬铃木花粉变应原蛋白Pla a3 的编码序列(coding sequence, CDS), 构建到原核表达载体Pet-32a 中并转化大肠杆菌Rosetta 菌株, 在28◦C 条件下经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导表达蛋白, 并进行纯化. 利用纯化后的Pla a3 重组蛋白免疫注射SD 大鼠, 然后利用悬铃木花粉浸取液混合Pla a3 重组蛋白对大鼠进行雾化处理[11-12]. 最后, 获取致敏大鼠血清并对其中所含抗体的特异性及其效价进行鉴定. 鉴定结果显示, 本工作获得了特异性良好、高效价的IgE 抗体, 可用于后续检测分析上海大气颗粒物中悬铃木花粉致敏蛋白Pla a3 的分布特征.

1.3 总蛋白测定

本工作采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒(增强型, 上海翊圣生物科技有限公司, 中国)测定大气颗粒物中的总蛋白质量浓度. 二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid, BCA)是目前应用比较广泛的蛋白质浓度测定方法. 基于双缩脲反应, 即在碱性条件下蛋白质将Cu2-还原成Cu-, 产生一种紫蓝色复合物, 在562 nm 处有高的吸光值. 该反应物的量与蛋白质浓度成正比. 具体操作步骤如下.

步骤1 预处理: 取1/8 采集颗粒物的滤膜, 用6 mL 的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)浸泡6 h; 将所得溶液在4◦C, 5 000 r/min 条件下离心20 min, 然后经0.45µm 过滤器过滤[13]后;再用真空浓缩仪(Eppendorf AG,德国)浓缩滤液到2 mL,-20◦C 保存备用.

步骤2 比色皿检测: 各取0.1 mL 标准品和待测样品加入反应管中, 每管加入2.0 mL BCA 工作液, 混匀, 37◦C 孵育30 min.

步骤3 冷却至室温, 在分光光度计上进行检测. 设定波长为562 nm, 在10 min 内对所有样品读数.

1.4 ELISA

ELISA 是指利用抗原与抗体的特异反应, 将待测物与酶连接, 然后通过酶与底物产生颜色反应, 用于抗原与抗体结合状况的定量测定. 具体操作步骤如下.

步骤1 预处理: 取1/8 采集颗粒物的滤膜, 用6 mL 的PBS 缓冲液浸泡6 h; 将所得溶液在4◦C, 5 000 r/min 条件下离心20 min, 然后经0.45µm 过滤器过滤后; 再用真空浓缩仪浓缩滤液到2 mL, -20◦C 保存备用.

步骤2 包被: 取96 微孔板, 每个反应孔中加100 µL 待测样品浓缩液(重复3 个孔),4◦C 避光孵育16 h, 以空白膜提取液为空白对照. 孵育结束后用PBST 洗涤液(加入0.5%Tween-20 的PBS 溶液)冲洗3 次, 每次5 min.

步骤3 封闭: 每孔加5%的脱脂奶粉溶液, 注满后37◦C 静置1.5 h 后洗涤, 洗涤条件同步骤2.

步骤4 孵育一抗: 加100µL 大鼠血清(1∶50), 37◦C 避光孵育1.5 h 后洗涤, 洗涤条件同步骤2.

步骤5 孵育酶标二抗: 加100µL 过氧化物酶标记的IgE 二抗(1∶10 000),37◦C 避光孵育1 h 后洗涤, 洗涤条件同步骤2.

步骤6 加底物显色液: 加入TMB 底物显色液200µL, 37◦C 避光孵育20 min.

步骤7 终止反应: 加2 mol/L H2SO450µL 终止反应. 利用酶标仪检测OD450吸收值, 通过比对标准曲线估算被测样品中变应原蛋白的质量浓度.

2 结果与讨论

2.1 上海春季大气颗粒物的粒径分布

由图1 可以看出, 2017 年春季采样期间, 粒径＞7 µm 的大气颗粒物的质量浓度为60～65µg/m3, 在3.3～7.0, 2.0～3.3, 1.1～2.0µm 的3 个粒径段的大气颗粒物的质量浓度较为接近,粒径＜1.1µm 的大气颗粒物的质量浓度为35～55µg/m3. 与上海市环境保护局发布的空气质量月报相比(http://www.sepb.gov.cn/fa/cms/xxgk//AC46/AC4602000/2017/05/96124.htm),PM2.5的质量浓度大体一致, 但是粗颗粒的浓度有明显变化, 其中本研究样品中粗颗粒物的比例较高. 这可能是因为本次采样为地表采样, 受到了地表扬尘的影响. 在＞7.0,3.3～7.0, 2.0～3.3µm 这3 个较大粒径段内的颗粒物质量浓度在四月都有所升高, 但是1.1～2.0,＜1.1µm 小粒径段内的颗粒物质量浓度并没有升高. 这可能是由于四月份有一次沙尘天气, 导致了空气中粗颗粒物的增加[14]. 同时这也说明细颗粒物是上海主要的大气污染物, 这与本课题组以往的研究结果相符[15-16].

图1 2017 年上海春季大气颗粒物样品的质量浓度Fig.1 Mass concentrations of atmospheric particulate matter in the spring of Shanghai, 2017

2.2 大气颗粒物中总蛋白的粒径分布

从图2 中可以看出, 在粒径最小(＜1.1 µm)的颗粒物中, 总蛋白的平均质量浓度为2.5～3.0 µg/m3, 且在整个采样期内总蛋白的质量浓度最大值为4.8 µg/m3. 由图1 和2 可以计算得到: 总蛋白占大气颗粒物的2.5%～5.6%; 所有粒径段的总蛋白的平均质量浓度为6.26 µg/m3, 颗粒物的平均质量浓度为176.38 µg/m3. 因此, 总蛋白质量浓度在颗粒物中的平均比例为3.55%. 而且2017 年4 月6 日所采集到的样品中的总蛋白主要集中在＞7.0 µm 粒径段. 这可能与当日的天气情况有关, 因为降雨而导致细颗粒中的蛋白质量浓度偏低. Kang等[17]的研究发现, 合肥地区的PM10中, 总蛋白来源主要有花粉、霉菌、细菌、真菌、孢子、昆虫粪便、皮屑等, 平均质量浓度为11.42 µg/m3, 且蛋白质量浓度与降水量呈反比关系. 本研究中总蛋白质量浓度及其日变化同样符合这一规律.

图2 大气颗粒物中总蛋白的粒径分布Fig.2 Size distributions of the total protein in atmospheric particulate matter

2.3 大气颗粒物中致敏蛋白Pla a3 的粒径分布

本研究采用标准曲线法定量大气颗粒物中致敏蛋白Pla a3 的质量浓度. 每次实验都以相同的纯化的rPla a3 蛋白为标样, 以50, 100, 200, 500, 1 000, 2 000 pg/mL 质量浓度梯度绘制标准曲线, 以此来测定颗粒物内Pla a3 的质量浓度. 由图3 可见: 大气颗粒物中的致敏蛋白Pla a3 主要集中在＞7.0 µm 的粒径段内, 其平均质量浓度为7.5 pg/m3, 而且在此粒径段内, 呈现先增多后降低的时间变化趋势, 与悬铃木的花期相吻合; 在3.3～7.0, 2.0～3.3, 1.1～2.0µm 这3 个粒径段内, Pla a3 蛋白的质量浓度相差不大, 约为1.8 pg/m3; 在＜1.1µm 的粒径段内, Pla a3 蛋白的质量浓度最低, 约为0.5 pg/m3. 由图2 和3 计算得到, Pla a3 蛋白占总蛋白的0.14%～0.29%. Fern´andez-Gonz´alez 等[18]的研究结果显示, 在西班牙奥伦塞市的大气中发现了悬铃木花粉致敏蛋白Pla a1 的存在, 而在2013 年3 月28 日检测到的Pla a1 蛋白的日最大质量浓度为1.2 ng/m3. 同时该研究还发现, 大气中Pla a1 致敏蛋白的质量浓度与当地的平均温度和最高温度成正相关, 与相对湿度呈负相关. 而在本工作中, 检测到大气中致敏蛋白Pla a3 的日平均质量浓度为15 pg/m3, 远低于致敏蛋白Pla a1 的质量浓度. 这可能是因为悬铃木花粉中Pla a3 蛋白的表达量远低于Pla a1 蛋白的表达量. 通过建立甄别大气中Pla a3 致敏蛋白的质量生物学模型, 测定大气中Pla a3 致敏蛋白的质量浓度水平, 可以为预防花粉症及过敏性哮喘病提供一定的数据支持.