冷榨花生粉中蛋白质的超声波辅助提取试验研究

夏潇潇　湛琴琴　姜明敏　王飞

摘要 以冷榨花生粉为原料，使用超声波辅助Tris-HCl溶液提取冷榨花生粉中的蛋白质，考察液料比、超声时间、超声频率和提取温度对花生蛋白提取率的影响。单因素试验和正交试验结果表明，当液料比为50∶1、超声时间为20 min、超声频率为70 kHz、提取温度为 40 ℃时，冷榨花生粉中蛋白质的提取率可达87.22%。

关键词 冷榨花生粉;超声波;蛋白;提取率

中图分类号 TS21文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）16-0220-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.062

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Ultrasound assisted Extraction Experiment of Protein from Cold pressed Peanut Powder

XIA Xiao xiao，ZHAN Qin qin，JIANG Ming min et al （Department of Biology & Environmental Engineering，Hefei University，Hefei，Anhui 230601）

Abstract Cold pressed peanut powder was used as raw material to extract protein with Tris HCl solution assisted by ultrasound.The effects of liquid to material ratio，ultrasonic time，ultrasonic frequency and temperature on the extraction rate of peanut protein were investigated. The results of single factor experiment and orthogonal experiment showed that the extraction rate of protein in cold pressed peanut powder could reach 87.22% when the liquid to material ratio was 50∶1，the ultrasonic time was 20 min，the ultrasonic frequency was 70 kHz and the extraction temperature was 40 ℃.

Key words Cold pressed peanut powder; Ultrasonic wave; Protein; Extraction rate

花生被譽为“长生果”“植物肉”“绿色牛乳”[1]，是一种重要的油料作物，也是植物蛋白质的重要来源之一。花生蛋白营养价值高，含有人体必需的氨基酸，不含胆固醇，且消化系数在90%以上[1-2]。

传统的蛋白质提取方法存在耗时长、效率低、操作繁琐等缺点[3-4]。超声波是一种机械能量形式[5]，能在液态体系中产生空化效应。强烈的空化效应会让空化泡在崩溃的同时瞬间释放局部高温和高压，因而会产生剧烈冲击、剪切等作用力。当空化效应发生在植物组织周围时，可以引发细胞破碎，促进目标物质的释放和溶出[5-7]。因此，超声波是一种有效的辅助萃取手段，已被广泛应用于天然产物、生物活性物质、功能改性等领域，是一种安全、绿色、环境友好的提取方法[8-14]。笔者采用超声波辅助Tris-HCl溶液提取冷榨花生粉中的蛋白质，对影响其提取率的因素（液料比、超声时间、超声频率和提取温度）进行了优化，旨在为其工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 花生，购于安徽省合肥市滨湖永辉超市;考马斯亮蓝G-250，购自国药集团化学试剂有限公司;三羟甲基氨基甲烷，购自上海阳光生物科技有限公司;氢氧化钠，购自西陇化工股份有限公司;盐酸，购自江苏强盛功能化学股份有限公司;硫酸，购自西陇化工股份有限公司，试验试剂均为分析纯。标准蛋白，购自北京索莱宝科技有限公司，优级纯GR。蒸馏水，自制。

1.2 仪器与设备

MI-S1榨油机，为中山麦尔尼电器有限公司产品;DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱，为上海光都仪器设备有限公司产品;Centrifuge5810高速台式离心机，为德国Eppendorf AG公司产品;722可见分光光度计，为上海佑科仪器仪表设备有限公司产品;JK-DYJ500金尼克超声波清洗器，为合肥金尼克机械制造有限公司产品;pHS-25 pH计，为上海仪电科学仪器产品。

1.3 试验方法

1.3.1 花生总蛋白的测定。花生中的蛋白质总量采用凯氏定氮法测定。①称取0.2 g样品粉末，精确至0.001 g，移入干燥的25 mL定氮瓶中，加入0.2 g硫酸铜、6 g硫酸钾，再加入20 mL浓硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上，在温度约100 ℃条件下小心预热2 h，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，将温度升至350 ℃，并保持瓶内溶液微沸状态，待溶液由黑色变为棕黄色，再变为蓝绿色并澄清后，再继续加热1 h。取下冷却，小心加入 20 mL纯净水。放冷后，移入100 mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。②将装有消化溶液的定氮瓶放入定氮仪，接通冷凝水开启仪器经过加碱、硼酸、加热、酸化、滴定，最终得到样品中的蛋白质含量。有机物中的铵根在强热条件下与CuSO 4、浓H 2SO 4作用，硝化生成（NH 4） 2SO 4。③用已知浓度的H 2SO 4标准溶液滴定，根据HCl消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，即得蛋白质的含量。蛋白质含量的计算公式：

蛋白质含量= N×6.25

式中，N为含氮量，N（%）=[1.401×M×（V-V 0）]/W;M为标准酸的摩尔浓度（mol/mL）;W为样品的重量（g）;V 0为空白样滴定标准酸的消耗量（mL）;V为样品滴定标准酸的消耗量（mL）。

1.3.2 花生中蛋白质的提取步骤。花生中蛋白质的提取步骤如下：新鲜花生→冷榨去油→粉碎→取适量称重→加入Tris-HCl溶液进行超声波辅助萃取→离心→取上清液→测定蛋白质的提取质量。

1.3.3 Lowry试剂盒法测定蛋白质含量。取5 μL样品置于 5 mL离心管中，然后加入250 μL RC Reagent Ⅰ，并振荡，室温下静置1 min，然后加入250 μL RC Reagent Ⅱ，振荡，然后进行15 000 r/min离心7 min，去上清，留沉淀，取干净50 mL大离心管，加入100 μL DC Reagent S和5 mL DC Reagent A混匀，然后取255 μL混合液加入离心后沉淀物中，振荡摇匀，静置 15 min，最后用分光光度计于波长750 nm下测定溶液吸光度。

1.3.4 蛋白质提取率的计算。按以下公式计算蛋白质提 取率：

蛋白质提取率=超声波辅助提取蛋白质量（g）冷榨花生粉中蛋白质含量（g）×100%

2 结果与分析

2.1 冷榨花生粉中蛋白质总量

使用凯式定氮仪测得冷榨花生粉中总蛋白质含量为48.3%。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 液料比对蛋白质提取率的影响。

当提取时间为 15 min，超声频率为60 kHz，提取温度为40 ℃时，考察不同液料比，即20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 （mL∶g）对蛋白质提取率的影响，结果如图1所示。

由图1可知，冷榨花生粉中蛋白质的提取率随着液料比的提高而升高，当液料比达到50∶1后，随着液料比的持续加大，蛋白质提取率的上升速度變缓。这是因为萃取溶剂适度增加有利于蛋白质与溶剂的接触，增大扩散作用。当目标蛋白质量确定时，大部分蛋白质已被萃取，此时再增加萃取液用量，提取率缓慢增长，溶液中蛋白质浓度下降，造成萃取剂 浪费。

2.2.2 超声时间对蛋白质提取率的影响。

当液料比为50∶1，超声频率为60 kHz，提取温度为40 ℃时，考察不同超声时间（5、10、15、20、25 min）对蛋白质提取率的影响，结果如图2 所示。

从图2可以看出，随着超声时间的增加，冷榨花生粉中蛋白质的提取率先增加后减小，在超声辅助萃取时间为 20 min 时达到最大。这是因为超声波能引起特殊的空化效应，空化效应瞬间形成的高温高压可以破坏植物细胞组织，从而促使有效成分大量释放[15]。但若超声时间过长，超声会引起局部过热，从而破坏蛋白质的组织结构，使其提取率降低。

2.2.3 超声频率对蛋白质提取率的影响。

当液料比为 50∶1，提取时间为15 min，提取温度为40 ℃时，考察不同超声频率（40、50、60、70、80 kHz）对蛋白质提取率的影响，结果如图3所示。

超声频率越小，瞬态空化效应越显著，形成的瞬间冲击波和射流能破碎植物细胞，促进蛋白质溶出，提高提取效率，但瞬态空化效应过强也会破坏被提取蛋白质的结构，引发蛋白质变性沉淀;超声频率越大，萃取液的稀薄相会减小，空化效应向稳态空化转变，空化效应减弱，萃取液在花生粉周围形成微流，而植物细胞被破坏程度小，目标物质的提取率低。由图3可以看出，随着超声频率的增加，冷榨花生粉中蛋白质的提取率先增加后减小，当超声频率为60 kHz时，蛋白质的提取率达到最大值。

2.2.4 提取温度对蛋白质提取率的影响。

当提取液pH为 8.0，提取时间为15 min，液料比为50∶1，超声频率为60 kHz时，考察不同提取温度（20、30、40、50、60 ℃）对蛋白质提取率的影响，结果如图4所示。

由图4可知，冷榨花生粉中蛋白质的提取率随着提取温度的升高呈先增大后减小的趋势。当提取温度过高时，会引起蛋白质的分子结构发生变化，蛋白质发生沉淀，Tris-HCl溶液的蛋白质提取率下降。

2.3 正交试验 在单因素试验结果的基础上，设计正交试验，确定最佳固定化条件，每组试验重复3次。正交试验的因素与水平设计见表1，正交试验结果见表2。

从表2可以看出，优化方案为A 2B 3C 2D 2，影响冷榨花生粉中蛋白质提取率的因素从低到高依次为超声时间、超声频率、提取温度、液料比。因此，冷榨花生粉中蛋白质提取的最优方案：液料比50∶1（mL/g）、超声时间20 min、超声波频率70 kHz、提取温度为40 ℃。

2.4 验证试验

根据正交试验得到的最佳固定化条件进行3次平行验证性试验，结果发现在液料比50∶1、超声时间 20 min、超声频率70 kHz、提取温度40 ℃的条件下，冷榨花生粉中蛋白质的提取率为87.22%。

3 讨论

超声波的空化效应可以破坏植物细胞结构，能有效促进目标物质溶解于萃取溶剂，但由于蛋白质的空间结构易被破坏，因此在实际操作中需要考虑超声频率、时间、温度等因素对蛋白质结构的影响[16-18]。该研究对影响超声波辅助提取冷榨花生粉中的蛋白质的4个因素（液料比、超声时间、超声频率和提取温度）进行优化，最终确定超声波辅助萃取冷榨花生粉中的蛋白质的最优条件如下：液料比50∶1、超声时间 20 min、超声频率70 kHz、提取温度40 ℃，在此条件下蛋白质的提取率可达87.22%。

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