利用CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑 技术创制抗除草剂西瓜新种质

田守蔚 姜临建 崔霞霞 张洁 郭绍贵 李茂营 张海英 任毅 宫国义 宗梅 刘凡 陈其军 许勇

目的与意义：草害严重威胁了西瓜的产量与品质，然而在中国注册的西瓜除草剂只有5种，且对阔叶杂草控制效果较差，因此急需有效的瓜田杂草控制方案。培育抗除草剂西瓜新品种是解决西瓜田间草害的有力措施，但依靠传统的育种手段几乎无法实现。因此，笔者希望利用CRISPR/Cas9单碱基编辑技术对西瓜ALS基因（编码乙酰乳酸合成酶，植物支链氨基酸生物合成关键酶）190位的脯氨酸位点进行编辑，获得具有抗ALS类除草剂的西瓜新种质，为西瓜田阔叶杂草的控制提供有效的技术方案。

材料与方法： 将包含西瓜ALS基因190位点的gRNA构建至CRISPR/Cas9单碱基编辑载体pBSE901中，其中BE3（第三代单碱基编辑器）由2个35S启动子启动（原图1-b），可以在西瓜基因组靶点处3～9 bp的位置实现C碱基的改变（原图1-a）。将构建好的载体转化农杆菌EHA105菌株以农杆菌介导的转化方法转化至西瓜ZG94的子叶。阳性再生植株通过胶体金免疫分析试纸及Sanger测序鉴定。

结果与分析：（1）单碱基编辑效率达23%：T0代共获得199株阳性株，测序结果表明，有45株发生C至T突变，表明单碱基编辑效率高达23%。其中有34株仅在第7位发生C至T转换，另外11株植株在位置7和8均发生了C至T的转换（原图1-c）。（2）编辑位点稳定遗传：对T0代的株系1、4及6的T1代基因型进行分析，结果显示，后代分离过程中再次编辑的发生在很大程度上使等位基因分离复杂化，但结果清楚地表明点突变可以高效的遗传给下一代。（3）T1获得不含转基因成分的抗性株：通过PCR、胶体金免疫分析试纸测试及草铵膦处理等多种检测手段，来自株系1、4、6 T1代的7/24、6/20和4/19植株含有碱基编辑的等位基因但没有BE3基因，这些植株在构建的T-DNA区域不含bar基因翻译的PAT蛋白，证明T1代即可獲得不含转基因成分的P190S单碱基编辑纯合株。（4）P190S除草剂抗性水平及生长水平评估：单碱基编辑获得的P190S纯合植株与野生型对照同时用苯磺隆（针对阔叶杂草控制非常有效的ALS类除草剂）处理。1 hm2 17 g苯磺隆（ai）处理后14 d，所有野生型植株都严重受损，P190S植株不受影响（原图1-e），1 hm2 68 g处理纯合P190S植株时发生轻微损伤，但在处理后30 d内恢复正常生长。P190S纯合株的果实、种子大小及种子产量与野生对照没有差异。

结    论：成功建立了西瓜高效单碱基编辑体系，创制了不含转基因成分的抗除草剂西瓜新种质。这些无转基因成分的碱基编辑抗除草剂西瓜植株在遗传学上与传统诱变育种相同，且单碱基编辑点突变对西瓜正常生长无不良影响，因此这种抗除草剂西瓜新种质可以进行田间应用。本研究结果表明，CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑系统是改良西瓜种质的强大工具。