HPLC-MS/MS法测定大鼠血浆样品中4-FMA含量

郑茜，温美强，2，贾娟，王涛，尉志文，马红娟，王优美，徐鹏，贠克明

（1.山西医科大学，山西 太原 030001；2.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110000；3.公安部禁毒情报技术中心 国家毒品实验室，北京 100193）

新精神活性物质（new psychoactive substance，NPS）是不法分子为逃避打击而对管制毒品进行化学结构修饰得到的毒品类似物，具有与管制毒品相似或更强的兴奋、致幻、麻醉等效果，成为继传统毒品、合成毒品后全球流行的第三代毒品[1]。

4-氟甲基苯丙胺（4-fluoromethamphetamine，4-FMA）属于苯丙胺类NPS[2]，能够通过诱导多巴胺、去甲肾上腺素及5-羟色胺的释放，产生较强的神经兴奋和致幻作用，活性比苯丙胺及甲基苯丙胺（methamphetamine，MA）更强[3]。国家市场监督管理总局（原国家食品药品监督管理总局）于2015年将其列入《非药用类麻醉药品和精神药品管制品种增补目录》进行管控。由于4-FMA出现较晚，管制较迟，对于4-FMA的检测研究还未充分开展，目前报道的生物检材涉及头发[4]、唾液[5]及血清[6]样品。本研究拟建立大鼠血浆中4-FMA的高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）分析方法，为4-FMA在大鼠体内的代谢动力学研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

6460三重四级杆高效液相色谱串联质谱仪（美国Agilent公司），TGL-16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂），Vortex-Genie 2涡旋混合器（美国Scientific Industries公司），移液枪（德国Eppendorf公司），Milli-Q®Integral超纯水系统（德国Merck Millipore公司）。

4-FMA、MA由公安部禁毒情报技术中心提供；甲醇、乙腈为色谱纯，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；实验用水为实验室自制超纯水。

1.2 实验动物

Wistar大鼠，质量约250 g，购自山西医科大学动物实验中心。雌雄分笼，自由摄食和饮水，标准饲料喂养。室温控制在25℃左右，相对湿度维持在60%～70%，昼夜周期条件为12h光照、12h黑暗。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Poroshell 120 EC-C18柱（50mm×3.0mm，2.7 μm，美国Agilent公司），流动相由含0.1%甲酸的水溶液与含0.1%甲酸的乙腈溶液（体积比为85∶15）组成，流速为0.4mL/min，柱温25℃，进样量2μL。

1.3.2 质谱条件

采用电喷雾离子源，离子源温度为300℃，雾化器温度305℃；氮气流速为11.0 L/min，毛细管电压4000V；采用正离子模式、多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式扫描分析。

1.4 储备液、工作液及校正标样的制备

分别精密称取10 mg 4-FMA和MA标准品于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成1.0 mg/mL的4-FMA和MA储备液。精密吸取MA储备液适量，用甲醇稀释至质量浓度为2.5μg/mL的MA内标工作液。取4-FMA储备液适量，经甲醇逐级稀释，得到质量浓度分别为 10 000、5 000、2 500、1 000、500、250、100、50 ng/mL的标准曲线工作液和质量浓度分别为100、2500、10000ng/mL的低、中、高质量浓度质控样品工作液。

1.5 血浆样品处理

精密吸取血浆样品100μL，置于1.5mL塑料离心管中，加入内标MA（2500ng/mL）10μL、甲醇500μL，涡旋混合30 s，以离心半径10 cm，13 000 r/min，离心10 min，取上清液400 μL，用0.22 μm微孔滤膜过滤，进样量为2μL。

1.6 大鼠体内实际应用

取Wistar大鼠3只，体质量250 g，灌胃给予4-FMA 26mg/kg，于给药前及给药后0.5、1.0、3.0h分别通过眼眶取血0.5mL。采用1.5节方法处理并检测分析（超出线性范围者用超纯水稀释后再进行分析）。

1.7 方法学考察

专属性：将空白血浆、空白血浆加标样品和染毒大鼠血浆样品按1.5节处理后进样分析。

标准曲线：取100 μL空白血浆，加入不同质量浓度的4-FMA标准曲线工作液或质控样品工作液10 μL，配成质量浓度为5、10、25、50、100、250、500、1000ng/mL的血浆样品，按1.5节处理后进样分析。

检出限和定量限：考察4-FMA质量浓度为1、3、5ng/mL时的信噪比（S/N），以S/N≥3作为检出限（limit of detection，LOD），S/N≥5作为定量限（limit of quantitation，LOQ）并对LOQ进行准确度和精密度考察。

精密度、准确度：配制低、中、高3个质量浓度（10、250、1000ng/mL）的血浆质控样品，按1.5节处理后进样分析并计算，每个质量浓度平行6份。同日测定，得日内精密度；连续测定3d，得日间精密度。精密度均以相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示，准确度均以相对误差（relative error，RE）表示。

提取回收率与基质效应：取低、中、高3个质量浓度的血浆质控样品100μL，按1.5节处理后进样分析，设待测物MRM峰面积为A。取低、中、高3个质量浓度的质控溶液10 μL，加入内标溶液10 μL和经前处理后的6种不同来源的空白血浆提取液600μL，进样分析，记录待测物MRM峰面积为B，将待测物与内标物MRM峰面积比值设为X，按公式A/B×100%计算待测物提取回收率。另取低、中、高3个质量浓度的血浆质控溶液10μL，分别依次加入内标溶液10μL、甲醇600μL，进样分析，记录待测物与内标物MRM峰面积比值为C。按公式X/C×100%计算待测物内标归一化基质因子[7]。每个质量浓度均平行6次。

稳定性：分别考察低、中、高3个质量浓度的血浆质控样品在24 h内3次反复冻融的稳定性[8]（25℃→-20℃）、长期冻存稳定性（-20℃冰箱冷冻放置15d）、样品制备后室温（25℃）放置4h的稳定性以及4℃放置24h的稳定性，计算不同处理后样品检测的准确度和精密度，如结果绝对值均不超过15%则认为稳定性良好。

残留效应：在高质量浓度（1000ng/mL）样品进样后立即进一个空白样品，考察待测物与内标的残留效应。

2 结 果

2.1 仪器条件的优化

质谱条件优化通过调节质谱的碎裂电压和碰撞能量值，使得离子的响应值最佳。4-FMA和MA的MRM离子及所需裂解电压、碰撞能量等见表1。

表1 4-FMA、MA的质谱参数

2.2 方法学考察

专属性：血浆中内源性物质不干扰4-FMA与MA的测定，具有较高的专属性，如图1所示，4-FMA和MA的保留时间分别为1.93和1.51min。

标准曲线：以4-FMA的质量浓度为自变量（x），4-FMA与MA的定量离子对峰面积比值为因变量（y），采用加权最小二乘法（权重系数1/x2）进行线性回归，可得4-FMA血浆质量浓度为5～1000ng/mL时的标准曲线回归方程为：y=0.0004+0.0031x（r=0.9992）。

检出限和定量限：4-FMA血浆样品的LOD为3 ng/mL，LOQ为5 ng/mL，在质量浓度为5 ng/mL时样品的准确度和精密度分别为0.16%和3.21%。

精密度、准确度：4-FMA 3个质量浓度质控样品的日内精密度和日间精密度RSD值均小于8.16%，准确度为-2.0%～3.2%。精密度和准确度均良好，见表2。

提取回收率与基质效应：结果显示提取回收率＞90%，RSD＜5.62%。4-FMA质控样品低、中、高3个质量浓度的内标归一化基质因子分别为101.0%、97.0%、100.0%，大鼠血浆基质对4-FMA测定的影响可以忽略，详见表2。

图1 4-FMA与内标物MA的MRM色谱图

稳定性：处理后样品经24 h内3次反复冻融（25℃→-20℃）、长期冻存（-20℃，15d）、室温（25℃）放置4 h、4℃放置24 h后均能稳定存在，检测样品的相对偏差为-10.7～9.2%，符合要求。

残留效应：结果显示，待测物与内标在高浓度进样后均没有残留。

2.3 实际应用

采用标准曲线法计算得到大鼠血浆中4-FMA的含量，详见表3。

表3 大鼠给予4-FMA前及给药后不同时间的血药质量浓度 （ng/L）

3 讨 论

目前，国内外对苯丙胺类的毒品检测多采用气相色谱（gas chromatography，GC）[6]、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[9]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）[10]、LC-MS/MS[11-12]等方法。相对于其他方法，本研究所建立的HPLC-MS/MS法不需要衍生化，分析时间只需2.5 min；检测灵敏度高，能达到3 ng/mL；采用MRM模式，选取两个离子对定性，准确度好。在实际毒品检测实践中，所能获得的血液样品量往往较少，毒物含量很低，且要求很快得出结果。本研究所建立的HPLC-MS/MS法能满足血浆样品中4-FMA的检测需求。

本研究所建立的大鼠血浆样品中4-FMA含量的HPLC-MS/MS测定方法，以MA为内标，采用甲醇沉淀蛋白后直接进样分析，操作简单、快速，可避免因操作繁琐引起误差，并且降低了检测成本。方法学考察结果表明，本方法准确性、精密度、提取回收率均良好，LOQ达到5ng/mL，能够对微量样品进行准确定量。实际应用证明本方法能够满足大鼠体内毒代动力学研究检测要求，为了解4-FMA在动物体内的动力学特征和分布，以及对其毒理学研究和NPS滥用的司法鉴定提供了方法基础。