血清miR-25与胃癌病理诊断和预后的相关性研究

毕书祝，杨 越，牛 平，王 梅

胃癌预后判断主要根据患者的临床数据和病理分期确定［1］，但临床缺乏能够预测预后和转移的高度敏感和特异性的生物标志物，这使胃癌患者的早期诊断成为难点。miRNA是一种小的非编码RNA分子，可调节多种靶基因的表达，并在各种生理和病理过程中发挥重要作用［2，3］。 miRNA 在许多恶性肿瘤中失调，在恶性肿瘤的发生发展中起重要作用［4-8］。 研究发现，miR-25在人 GC细胞系，组织和血清/血浆样品中过度表达［9，10］，该研究旨在检测血清miR-25在胃癌患者中的表达水平，探讨miR-25作为胃癌患者诊断和预后标志物的可能性。

1 资料与方法

1.1 一般资料青岛大学附属医院的184名胃癌患者作为研究对象。所有患者在2006年4月—2010年1月10日接受胃癌根治性切除，并行内镜诊断和活检。术前化疗患者未纳入研究。黄岛区人民医院的78名健康人员和56例胃炎患者作无癌对照。

1.2 方法（1）RNA提取。诊断或手术前以及健康志愿者中取外周血（7 ml），提取血浆并将血浆储存在-80℃。然后按照常规生化方法提取总RNA。储存于-80℃冰箱中用于后续实验。（2）qRT-PCR分析。根据制造商的手册（Biomics，Jiangsu Nantong）进行反转录和qRT-PCR，使用U6 siRNA作为内部对照。25 μl qRT-PCR反应系统含有3 μl总RNA提取物、miR-25和U6特异性引物、正向和反向引物以及2x主混合物。PCR条件包括在42℃下反转录30 min；95℃变性 10 min；40个循环的 95℃变性20 s，60℃退火 30 s，72℃伸长 30 s。在 72℃下收集荧光信号。使用ΔCt=CtmiR-25-CtU6分析数据。2-ΔCt代表患者血浆中的相对miR-25表达。

1.3 统计学分析使用SPSS 22统计软件包进行所有统计分析，所有数据均表示为x±s，非配对t检验或Mann-Whitney检验用于分析受试者和对照之间的差异或miR-25水平的平均值与患者临床病理学特征之间的相关性。ROC曲线和ROC曲线下面积（AUC）值用于评估miR-25水平作为GC诊断的可行性；使用Cox进行单变量和多变量生存分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般特征检测了184例胃癌患者的血清miR-25水平并与78名健康对照者和56例胃炎患者的miR-25水平相比较。胃癌患者的中位年龄为63.6岁（33～81岁），78名健康者中位年龄为62.8岁（32～80岁），76例胃炎患者中位年龄为62.7岁（34～79），胃癌组与其他两组的患者年龄相比无显著差异（P＞0.05）。胃癌患者男性和女性的数量分别为112例（60.9%）和72例（39.1%），健康对照组分别为44例（56.4%）和34例（43.6%），胃炎患者分别为42例（53.8%）和36例（46.2%），性别之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 血清miR-25水平与胃癌患者临床病理特性的关系健康对照组患者的血清miR-25水平为（0.012±0.008），胃炎患者为（0.014±0.010），胃癌患者为（0.063±0.040）。胃癌患者血清miR-25表达显着高于健康对照组（P=0.006）和胃炎组（P=0.006），健康对照组和胃炎组的血清miR-25浓度无明显差异（P=0.742）。高血清浓度的miR-25与胃癌的T分期（P=0.026）淋巴结转移（P=0.002）和疾病分期（P=0.003）呈正相关（均 P＜0.001）。 见表 1。

2.3 血清miR-25水平升高与胃癌患者的不良预后相关Kaplan-Meier分析血清miR-25与总体存活率之间的关系。血清miR-25的cutoff值为0.042，65%（120/184）GC 患者血清 miR-25水平升高，35%（64/106）血清miR-25水平降低。低血清miR-25水平胃癌患者的存活率明显升高（图1a，P=0.0028）。为了进一步评估血清miR-25在不同TNM分期患者中的诊断准确率，笔者将患者分为早期（Ⅰ～Ⅱ）和晚期（Ⅲ～Ⅳ）组。在TNM的Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ亚组中，血清miR-25水平能准确性预测TNMⅠ和Ⅱ分期，以及TNMⅢ和Ⅳ分期（图1b～1c）。单变量Cox分析发现：肿瘤大小、血管侵犯、T分期、淋巴结转移、远处转移、TNM分期和血清miR-25是胃癌患者的危险因素（表2）。多变量Cox分析将肿瘤大小、T分期、淋巴结转移和血清miR-25鉴定为胃癌的独立危险因素 （表2）。这些数据表明高血清miR-25是预测胃癌患者预后不良的独立因素。

表 1 血清 miR-25水平与胃癌患者临床病理特性的关系

2.4 血清miR-25水平对胃癌患者的诊断价值ROC曲线分析血清miR-25的诊断价值：根据血清miR-25的表达水平可以鉴别胃癌患者与对照组的健康人员及胃癌患者。血清miR-25区分胃癌患者和健康对照组敏感性为69.4%，特异性为84.6%（P＜0.0001，［CI］：0.662-0.817）（图 2）；此外，miR-25 区分GC患者和胃炎对照组的敏感性为67.3%，特异性为 80.4%，最佳临界点的 AUC为 0.732（P＜0.0001，［CI］：0.653-0.794）（图 2）。

3 讨论

由于胃癌缺乏高敏感性和非侵入性的诊断标志物，对其早期诊断带来困难，也是造成胃癌患者预后不良的重要原因。miRNA可以通过分泌外泌体颗粒从癌细胞释放到体液中，保护它们免受RNase在循环中的降解［11］。在血清、血浆、尿液、泪液、羊水和胃液中可检测到多种循环 miRNA［12，13］。 体液中循环的miRNA不同表达方式与某些病理状态下的不同细胞类型有关［14］。因此，miRNA可能是胃癌诊断的非侵入性生物学标志物。有研究发现，血清中循环miRNA的表达水平与肿瘤组织中的表达水平相一致，它们可以作为肿瘤检测的生物标志物［13］。

最近发现，在病理生理条件下，miR-25是一种致癌的miRNA。它在许多肿瘤类型的发展中起着至关重要的作用，包括脑肿瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、食道癌、胃癌、结肠直肠癌和肝细胞癌等［15］。临床研究还发现：miR-25在胃癌Ⅰ～Ⅲ期患者的组织和（或）血浆/血清样品中升高［16］。在我们的研究中，胃癌患者的血清miR-25浓度增加，并且高血清浓度的miR-25与胃癌的T分期、淋巴结转移和疾病分期呈正相关。而miR-25的血清表达水平与其他临床病理学指标之间没有相关性。预后分析显示，血清浓度高的miR-25患者的生存率低于血清miR-25浓度低的患者。根据多变量分析的结果，miR-25的血清浓度是胃癌患者中OS和RFS的独立预后指标。该研究结果表明，胃癌患者miR-25的血清浓度可作为胃癌可行的预后生物标志物。ROC曲线分析还证实，血清miR-25水平有助于区分PC患者与健康对照者和胃炎患者的敏感性和特异性指标。因此，血清miR-25水平可能是胃癌的诊断标志物，但其敏感性和特异性仍然相对较低。如果血清miR-25结合 sCEA，CA19-9，CA72-4，CA125和甲胎蛋白等其他胃癌血清标志物，则可提高胃癌的诊断率。虽然血清miR-25具有较低的敏感性和特异性，但在判断肿瘤分期、淋巴结转移和预后方面具有很大优势，对指导晚期胃癌的治疗具有重要意义。