胃癌患者血浆miR-216a表达及其对胃癌细胞恶性生物学行为的调控作用

2019-09-19任娟余青龙卞西杰张帮柱曾安贵

疑难病杂志 2019年9期

任娟，余青龙，卞西杰，张帮柱，曾安贵

胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，手术治疗、放化疗等用于胃癌的治疗使患者的预后得到了一定改善，但受到局部肿瘤复发、淋巴结转移、远处器官转移等因素的影响，胃癌患者的整体生存情况并不乐观[1-2]。目前，胃癌的发病机制仍未阐明，进而也限制了靶向治疗药物的研发。微小RNA(miRs)是一种在转录后水平调节基因表达的小分子RNA，通过调节靶基因的表达来介导相应的生物学作用。miR-216a是具有抑癌特性的miR，在多项细胞研究中被证实能够抑制肺癌细胞、肾癌细胞、骨肉瘤细胞等恶性肿瘤细胞的增殖[3-5]。有研究报道胃癌病灶内miR-216a的表达明显下调[6]，提示miR-216a可能在胃癌的发生发展中起到抑癌作用。本研究首先分析了胃癌患者血浆miR-216表达的变化，进一步以胃癌细胞为实验对象分析了miR-216a对胃癌细胞恶性生物学行为的调控作用，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集2016年3月—2018年12月攀枝花学院附属医院普外科诊治的胃癌患者和同期于医院体检健康志愿者。胃癌患者均经病理学诊断且确诊时均接受过放化疗、生物治疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗，既往无其他恶性肿瘤病史。胃癌患者38例(胃癌组)：男22例，女16例，年龄39～61(45.67±8.23)岁；健康志愿者(健康组)50例：男 31例，女19例，年龄35～58(44.85±8.51)岁。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审批通过，全部受试者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 血浆miR-216a测定采集空腹肘静脉血3 ml，以天根公司的miRcute miRNA提取分离试剂盒和miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒分离血浆miR并反转录合成cDNA，采用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒对cDNA中的miR-216a进行扩增，根据扩增曲线计算miR-216a的表达水平[7]。

1.3 胃癌细胞增殖活力、信号通路测定

1.3.1 材料：胃癌细胞株SGC-7901购自 Sigma公司，细胞培养所用DMEM、胎牛血清(FBS)、0.125%胰蛋白酶购自Hyclone公司，细胞增殖MTS检测试剂盒购自Promega公司，蛋白裂解液购自Roche公司，miR-216a表达检测所用试剂盒购自北京天根公司，基因mRNA表达检测所用试剂盒购自北京康为世纪公司，PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的单克隆抗体及相应的第二抗体购自SantaCruz公司。

1.3.2 细胞培养及分组：胃癌细胞株SGC-7901用含有10%FBS的DMEM处理，细胞融合至80%后用0.125%胰蛋白酶进行消化和传代，传代后的细胞分为miR-216a组(转染miR-216a的模拟物)和阴性对照组(转染NC的模拟物)。

1.3.3 细胞增殖活力检测：转染模拟物后6、12、18、24 h，向培养基中加入MTS试剂盒中的检测液，继续培养4 h，而后将培养板放置在酶标仪上，读取450 nm波长处的吸光值，以此作为增殖活力值。

1.3.4 增殖基因mRNA表达检测：转染模拟物后24 h，采用康为世纪公司的超纯RNA提取试剂盒和SuperRT cDNA第一链合成试剂盒分离细胞中的RNA并合成cDNA，采用UltraSYBR Mixture试剂盒对cDNA中的CyclinD1、Ki-67、Bcl-2、Gli-1、c-myc基因进行扩增，根据扩增曲线计算基因的mRNA表达水平。

1.3.5 信号通路分子蛋白表达检测：转染模拟物后24 h，采用蛋白裂解液分离提取细胞中的总蛋白，高温变性后将蛋白样本加入聚丙烯酰胺分离凝胶中，电泳分离蛋白后进行电转膜，将分离凝胶中的蛋白样本电转移至NC膜后用5%脱脂牛奶对NC膜进行封闭，2 h后用PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的第一抗体对NC膜进行孵育，4℃过夜后取出，孵育第2抗体2 h。最后用ECL显影系统显示得到PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的蛋白条带，根据条带灰度值计算蛋白表达水平。

2 结果

2.1 2组血浆miR-216a表达比较胃癌组血浆miR-216a表达为(0.64±0.10)，健康组为(1.02±0.18)，2组比较差异有统计学意义(t=11.703,P=0.000)。

2.2 2组胃癌细胞增殖活力值比较转染模拟物后6、12、18、24 h，miR-216a组的细胞增殖活力值明显低于阴性对照组 (P<0.05)，见表1。

2.3 2组转染模拟物对胃癌细胞中增殖基因表达比较转染模拟物后24 h，miR-216a组胃癌细胞中CyclinD1、Ki-67、Bcl-2、Gli-1、c-myc的mRNA表达水平均明显低于阴性对照组(P<0.01)，见表2。

2.4 2组转染模拟物对胃癌细胞中增殖信号通路蛋白表达比较转染模拟物后24 h，miR-216a组胃癌细胞中PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的蛋白表达水平均明显低于阴性对照组(P<0.05)，见表3。

3 讨论

胃癌发病机制及靶向治疗手段一直是消化道肿瘤领域的研究热点。miR-216a是具有抑癌特性的miR，在多种恶性肿瘤细胞中均被证实能够起到抑制细胞增殖、侵袭的作用，但关于miR-216a在胃癌中表达的变化及价值并未明确。为了明确miR-216a在胃癌发生发展中所起的作用，本研究首先对胃癌患者血浆中miR-216a表达的变化进行了分析，胃癌患者血浆中miR-216a的表达水平明显低于健康志愿者，提示miR-216a的低表达与胃癌的发生有关，增加miR-216a可能是治疗胃癌的潜在靶点。在此基础上，本研究进一步以离体培养的SGC-7901胃癌细胞株为实验对象，通过转染miR-216a的模拟物来增加细胞内miR-216a的表达，进而探究miR-216a对胃癌细胞增殖的调节及增加miR-216a对胃癌的潜在治疗价值。转染模拟物6、12、18、24 h后，miR-216a模拟物均能使胃癌细胞的增殖活力明显下降，提示miR-216a在胃癌发生发展过程中具有抑癌作用，增加miR-216a可能起到治疗胃癌的作用。

miRs发挥生物学作用的方式是在转录后水平调节基因表达，通过基因表达的改变产生生物学效应。miR-216a作为具有抑癌特性的miR，能够靶向抑制多种增殖基因的表达使增殖基因介导的促增殖作用减弱，进而发挥其抑癌作用。在胃癌发生发展过程中，CyclinD1、Ki-67、Bcl-2、Gli-1、c-myc是已知的重要增殖基因。CyclinD1编码的产物直接参与细胞周期进程的调控，能够加速细胞周期、促进细胞有丝分裂[8]；Ki-67的编码产物是一类核增殖抗原，在细胞核内参与DNA的复制并与细胞的增殖活力直接相关[9]；Bcl-2的编码产物对线粒体内细胞色素C的释放具有阻碍作用，通过阻碍细胞色素C释放来增强细胞的增殖活力[10-11]；Gli1和c-myc是2种原癌基因，能够通过多途径诱导细胞恶变、促进细胞增殖[12-13]。本研究在转染模拟物后24 h检测了细胞中上述增殖基因表达的变化，miR-216a组胃癌细胞中CyclinD1、Ki-67、Bcl-2、Gli-1、c-myc的mRNA表达水平均明显低于阴性对照组，表明miR-216a对胃癌细胞中多种增殖基因的表达具有抑制作用，进而提示靶向抑制增殖基因表达可能是miR-216a降低胃癌细胞增殖活力的分子途径。

在癌细胞增殖过程中，增殖基因高表达后表达产物引起细胞增殖活力的改变涉及复杂的生物信号转导。PI3K/AKT/mTOR信号通路和MEK/ERK1/2信号通路是与多种恶性肿瘤细胞增殖密切相关的通路。在PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活过程中，PI3K和AKT依次发生磷酸化并活化，进而引起mTOR发生磷酸化并启动下游多种增殖基因的表达[14-15]。在MEK/ERK1/2信号通路的激活过程中，MEK首先发生磷酸化活化，引起下游MAPK家族中的多个成员发生磷酸化后进一步造成ERK1/2磷酸化活化，活化的ERK1/2能够进入细胞核调节多种增殖基因的表达[16-17]。本研究在转染模拟物后24 h检测了细胞中上述信号通路分子磷酸化的程度，结果发现miR-216a组胃癌细胞中PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK1/2的蛋白表达水平均明显低于阴性对照组，提示miR-216a对胃癌细胞中介导增殖的PI3K/AKT/mTOR信号通路和MEK/ERK1/2信号通路具有抑制作用，通过抑制信号通路的活化来起到抗癌作用。