加味四君子汤对犬消化吸收功能及小肠EGF、SS表达的影响

2019-09-18夏晓冬贺濛初舒迎霜何嫣婷冯士彬李玉王希春吴金节

甘肃农业大学学报 2019年4期

夏晓冬，贺濛初，舒迎霜，何嫣婷，冯士彬，李玉，王希春，吴金节

(安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036)

四君子汤是补养剂中补气剂的经典方剂，临床上主治脾胃气虚、运化力弱病证[1].四君子汤的成分包括四种中药，人参、茯苓、白术、炙甘草.多糖被认为是四君子汤中最丰富的和主要的有效成分，研究发现，四君子汤及其组分S-3粗多糖具有增强免疫功能的作用，且四君子汤的总多糖能促进肠上皮细胞的增殖.四君子汤的药理作用主要有兴奋中枢，减轻疲乏感，调节神经内分泌和能量代谢等[2-4]，对于脾虚引发的消化吸收功能障碍、肠道炎症性疾病有很好的治疗效果，可调节肠道运动紊乱、水代谢紊乱等.四君子汤能够有效改善胰酶活性[5]，促进胃肠消化[6]，调节肠道菌群的多样性.近年来，中药制剂因其自身优势[7]，被广泛的应用为饲料添加剂.表皮生长因子(EGF)主要由颌下腺合成分泌，在胰腺、肝脏、十二指肠Brunner腺等组织器官中也有EGF的合成和分泌[7].EGF在刺激细胞增殖中起重要作用，能重塑组织，增加胶原蛋白和弹性蛋白[9-12].EGF与其受体的作用是黏膜上皮的增殖和迁移使溃疡面上皮化的重要因素[13].生长抑素(SS)是一种广泛分布的抑制性脑肠肽，可抑制多种胃肠激素的释放，减少胰腺的外分泌和胆汁分泌，抑制胃肠运动和胆囊收缩以及多种细胞的增殖、生长[14].SS可降低血液中促胰岛素及胆囊收缩素水平，也可经体循环抑制腺泡细胞，从两方面影响胰液的分泌，达到对食物分解速度调控的目的.

本试验在四君子汤基础上加味黄芪、山楂等，研究该加味四君子汤对犬小肠吸收率、胰腺消化酶水平、肠道内表皮生长因子(EGF)、生长抑素(SS)表达的影响，旨在探讨加味四君子汤对犬消化功能的作用及其机制，为加味四君子汤临床应用提供试验依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 1岁龄比格犬18只，由南京亚东试验动物研究中心提供.试验前进行常规免疫与驱虫，定量采食，自由饮水，隔离饲喂7 d.

1.1.2 试验主要器材与仪器 TD-100小型提取浓缩机组(浙江森力机械科技有限公司)，CX31正置光学显微镜(日本OLYMPUS公司)，YD-1508 R轮转式切片机(浙江金华益迪医疗设备厂)，HPX-9082MBE电热恒温培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，DW-86L388A -80 ℃冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)，FSH-2可调高速匀浆机(金坛市科兴仪器厂)，可控硅控温水浴锅(金坛市金城国胜实验仪器)，微量移液器(Eppendaorf)，TGL-18R台式高速离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)，TU-1901紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司).

1.1.3 中药材和试剂加味四君子汤原材料(党参、茯苓、炒白术、甘草、当归、黄芪、山楂等)购于安徽合肥梅山路立方大药房，D-木糖试剂盒购于南京建成生物工程研究所，胰蛋白酶试剂盒、胰脂肪酶试剂盒、胰淀粉酶试剂盒购于购于上海源叶生物科技有限公司，免疫组化一抗试剂购自美国ImmunoWay生物技术有限公司(EGF抗体编号：YT1481，SS抗体编号：YT4365)，二抗试剂购自北京中杉金桥生物科技有限公司(二抗编号：K183316A).

1.2 方法

1.2.1 中药制备加味四君子汤的制备：将中药原料按一定比例组方[15]，清洗去除杂质后连同清洗液投入提取罐中，料液比1∶10，浸泡3 h后提取2次，40 min/次，将2次提取液过滤后倒入浓缩罐浓缩成1 g/mL水煎剂，冷却后4 ℃保存.

1.2.2 试验犬分组以及饲养管理比格犬观察一周均无不良反应，将18只犬随机分为3组，即A组、B组、C组，每组6只.试验期间，3组试验犬饲喂管理条件均一致，每日饲喂2次基础日粮，每次150 g；根据预试验结果，设置1%和2%加味四君子汤两组添加剂量，即B组，饲粮中添加3 mL加味四君子汤；C组，饲粮中添加6 mL加味四君子汤.保证充足洁净饮水，犬舍每日打扫1次.常规消毒、免疫.

1.2.3 指标检测以及样本处理分别在第0、7、14 d使用非抗凝采血管采集血样5 mL静置30 min，3 000 r/min离心20 min，用移液枪取上清液置于EP管，保存于4 ℃冰箱.采集小肠组织中段放入多聚甲醛固定液，常规石蜡包埋，切片，免疫组化后，光镜观察蛋白在肠道内的表达情况，液氮中的小肠组织和胰腺组织放置于液氮速冻以后，保存于-80 ℃冰箱，用于测定mRNA相对表达量和胰腺消化酶水平.

1.2.4 D-木糖含量检测采用试剂盒测定血清中D-木糖含量，具体过程严格根据试剂盒说明书进行.

1.2.5 胰腺中消化酶水平的测定取0.5 g的胰腺组织，按照1∶9的比例加入4.5 mL生理盐水,用组织匀浆机在冰浴下进行充分匀浆，再经过12 000 r/min离心30 min，取上清液于EP管中，保存于4 ℃.胰腺组织中胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶水平测定按照试剂盒说明书测定.

1.2.6 小肠各段EGF、SS蛋白表达的检测采用常规免疫组化的方法检测小肠组织EGF、SS表达量，同时设置阴性对照，以PBS替代一抗，试验结束后用光镜对免疫组化肠道进行拍照，同一组织选择3个视野，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对图片进行分析统计，结果以平均光密度值表示.

1.2.7 小肠各段EGF、SS的mRNA相对表达量检测利用Trizol法提取试验犬各段小肠组织的总RNA.将提取到的总RNA采用SuperScript III RT反转录kit试剂盒合成cDNA.依据GeneBank中EGF、SS及内参actin的序列(GeneBank登录号分别为XM_014109884.2和NM_001003307.1).利用Premier 5.0软件设计引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1).使用Sybr qpcr mix试剂，采用ABI-7900实时荧光定量PCR检测小肠中EGF、SS mRNA相对表达量，结果以2-ΔΔCt表示.

表1 用于PCR扩增的引物序列

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 加味四君子汤对犬血清中D-木糖含量的影响

第0 d，各组差异均不显著(P>0.05).第7、14天，与A组相比，B组血清中D-木糖含量无显著差异(P>0.05)，C组血清中D-木糖含量显著增加(P<0.05).与B组相比，C组血清中D-木糖含量显著增加(P<0.05)，见表2.

2.2 加味四君子汤对犬胰腺消化酶水平的影响

与A组相比，B组3种消化酶水平均无显著差异(P>0.05)，C组均显著升高(P<0.05).与B组相比，C组3种消化酶水平均显著升高(P<0.05).结果见表3.

2.3 加味四君子汤对犬小肠EGF阳性表达水平的影响

IHC检测结果如图1所示，棕黄色区域为阳性表达产物，经苏木素复染，细胞核呈蓝色，细胞质为浅蓝色，细胞膜不着色.

由图1可见，试验犬各肠段均有EGF蛋白表达，阳性产物主要分布在肠绒毛两侧以及肠腺周围.图2反映了试验犬小肠各段EGF阳性表达的平均光密度值.由图可知，十二指肠、空肠中，与A组相比，B、C组EGF阳性表达量极显著升高(P<0.01)；与B组相比，C组EGF阳性表达量极显著升高(P<0.01).回肠中，与A组相比，B、C组EGF阳性表达量极显著升高(P<0.01)；与B组相比，C组EGF阳性表达量显著升高(P<0.05).

1：十二指肠；2：空肠；3：回肠；Y：阴性对照；A：对照组；B：1%加味四君子汤组；C：2%加味四君子汤组1：duodenum；2：jejunum；3：ileum；Y：negative control；A：control group；B：1% supplementary Sijunzi decoction group；C：2% supplementary Sijunzi decoction group.图1 犬小肠各段EGF阳性表达水平(400×)Figure 1 The positive expression level of EGF in the small intestine of canines(400×)

2.4 加味四君子汤对犬小肠EGF的mRNA表达量的影响

十二指肠中，与A组相比，B组EGF mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)，B组犬肠道EGF mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01)；与A组相比，B组EGF mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01).空肠中，与A组相比，B汤组EGF mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)，C组EGF mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01)；与B组相比，C组EGF mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01).回肠中，与A组相比，B、C组EGF mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01)；B组与C组EGF mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05，图3).

表2 加味四君子汤对犬血清中D-木糖含量的影响

同行数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).

In the same row,values with different small letter superscripts mean significance difference(P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significance difference(P<0.01)．

同行数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).

In the same row,values with different small letter superscripts mean significance difference(P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significance difference(P<0.01)．

同一组织不同处理组相比，图柱上标相同字母或者不标表示差异不显著(P>0.05)；上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；上标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).Among different groups in the same tissue,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05);different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).图2 犬小肠各段EGF平均光密度值Figure 2 The density mean of EGF in the small intestine of canines

同一组织不同处理组相比，图柱上标相同字母或者不标表示差异不显著(P>0.05)；上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；上标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).Among different groups in the same tissue,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05);different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).图3 犬小肠各段EGF mRNA的相对表达量Figure 3 The EGF mRNA relative expression values in the small intestine of the canines

2.5 加味四君子汤对犬小肠SS阳性表达水平的影响

IHC检测结果如图4所示，棕黄色区域为阳性表达产物，经苏木素复染，细胞核呈蓝色，细胞质为浅蓝色，细胞膜不着色.

由图4可见，试验犬各肠段均有SS蛋白表达，阳性产物主要分布在肠绒毛两侧以及肠腺周围.图5反映了试验犬小肠各段SS阳性表达的平均光密度值.由图可知，十二指肠中，与A组相比，B、C组SS阳性表达量极显著降低(P<0.01)；与B组相比，C组SS阳性表达量极显著降低(P<0.01).空肠中，与A组相比，B组SS阳性表达量无显著差异(P>0.05)，C组SS阳性表达量极显著降低(P<0.01)；与B组相比，C组SS阳性表达量极显著降低(P<0.01).回肠中，与A组相比，B组SS阳性表达量显著降低(P<0.05)，C组SS阳性表达量极显著降低(P<0.01)；与B组相比，C组SS阳性表达量极显著降低(P<0.01).

2.6 加味四君子汤对犬小肠SS的mRNA表达量的影响

十二指肠中，与A组相比，B、C组SS mRNA相对表达量均极显著降低(P<0.01)；与B组相比，C组犬肠道中SS mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01).空肠中，与A组相比，B组SS mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)，C组SS mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01)；与B组相比，C组SS mRNA相对表达量显著降低(P<0.05).回肠中，与A组相比，B、C组SS mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01)；与B组相比，C组SS mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)，结果见图6.

1：十二指肠；2：空肠；3：回肠；Y：阴性对照；A：对照组；B：1%加味四君子汤组；C：2%加味四君子汤组.1：duodenum；2：jejunum；3：ileum；Y：negative control；A：control group；B：1% supplementary Sijunzi decoction group C:2% supplementary Sijunzi decoction group.图4 试验犬小肠各段SS阳性表达水平(400×)Figure 4 The positive expression level of SS in the small intestine of the experimental canines(400×)

同一组织不同处理组相比，图柱上标相同字母或者不标表示差异不显著(P>0.05)；上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；上标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).Among different groups in the same tissue,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05);different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).图5 试验犬小肠各段SS平均光密度值Figure 5 The density mean of SS in the small intestine of canines

3 讨论

3.1 加味四君子汤对犬血清D-木糖的影响

D-木糖为右旋戊醛糖，不被肾小管重吸收，一部分经空肠黏膜上皮细胞进入血液，另一部分会迅速排入尿液中.在灌服一定量的D-木糖标准溶液后，间隔1 h对血液中的D-木糖含量进行测定，可评判胃肠道被动吸收能力的强弱.内服D-木糖后在小肠内以易化扩散的方式吸收，不需要耗能但与肠道黏膜完整度呈正比.加味四君子汤中含有多种抗氧化成分能消除细胞组织中自由基，具有提高机体抗氧化损伤机能，保护生物膜正常结构，有助于维持小肠黏膜形态结构的完整性，改善犬小肠的吸收功能[16].韩凌等[17]研究结果表明，加味四君子汤中的多糖成分可能作用于小肠上皮细胞.小肠是营养物质吸收的主要场所，肠道黏膜上皮细胞在吸收作用中扮演着重要的角色.本试验中2%加味四君子汤组与对照组犬相比，血清中D-木糖含量显著增加(P<0.05)，说明加味四君子汤可提高犬肠道吸收能力.

同一组织不同处理组相比，图柱上标相同字母或者不标表示差异不显著(P>0.05)；上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；上标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).Among different groups in the same tissue,the same or no letter superscripts indicate no significant difference(P>0.05);different small letter superscripts indicate significant difference(P<0.05);different capital letter superscripts indicate extremely significant difference(P<0.01).图6 犬小肠各段SS mRNA的相对表达量Figure 6 The SS mRNA relative expression values in the small intestine of canines

3.2 加味四君子汤对犬胰腺消化酶的影响

胰腺是动物机体一个具有外分泌、内分泌的腺体，外分泌的作用主要是分泌胰液，进入十二指肠从而发挥相应作用[18].促胰液素和胆囊收缩素是体液调节的2个重要激素，分别促进和抑制胰液的分泌.胰腺消化酶活性在一定程度上反应了动物机体的消化能力[19].本试验表明，加味四君子汤组犬胰腺组织中淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶活性较对照组犬显著升高，加味四君子汤能提高犬胰腺消化酶活性，增强犬消化功能.

3.3 加味四君子汤对犬肠道EGF蛋白及其mRNA相对表达量的影响

小肠黏膜上皮的完整度与消化吸收功能呈正相关[20-21].有研究表明，肠道上皮细胞的增殖和维持是由EGF的信号传导调控[22].目前，大量相关基础和临床研究表明EGF与胃肠道疾病有密切关系.EGF具有促细胞生长、细胞迁移、细胞增殖、伤口愈合及营养物质转运等生物学功能.本试验在犬饲料中添加加味四君子汤后，分析免疫组化结果发现，相比对照组犬，加味四君子汤组犬小肠绒毛顶部及肠腺周围的EGF蛋白水平显著提高(P<0.05)，2%加味四君子汤组试验犬肠道中EGF蛋白含量增加尤为显著；荧光定量PCR检测的结果也表明，在转录水平上加味四君子汤组犬肠道中EGF的mRNA的相对表达量明显增加.两个检测结果一致，说明加味四君子汤能增加犬肠道内EGF的含量，有利于维护肠道黏膜的完整性，保护和促进肠上皮细胞的生长、发育[23].

3.4 加味四君子汤对犬肠道SS蛋白及其mRNA相对表达量的影响

消化道的SS主要是由黏膜内D细胞分泌，有SS14和SS282种，大多分布在胃肠道和胰岛中.机体内注射SS后，胰液分泌减少，PH值改变，胰腺消化酶活性降低.迷走、胆碱能、肾上腺素能神经等可调控SS的基础释放，如M型胆碱能神经兴奋可刺激犬SS分泌.钟学军等[24]在模拟+Gz值暴露下形成的大鼠胃黏膜损伤研究SS含量变化，结果表明SS含量与胃黏膜损伤程度成正比.本试验通过免疫组化结果发现，饲粮中添加加味四君子汤后试验组犬肠道中SS蛋白水平较对照组显著下降(P<0.05)；荧光定量PCR检测的结果也表明，在转录水平上添加加味四君子汤组犬与对照组犬相比，SS的mRNA的相对表达量显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)，与免疫组化结果基本一致.