妊娠期糖尿病患者差异表达基因的生物信息学分析

尹志芳，李玉茹，杨宗梅，刘红，郝春霞

(天津市北辰医院，天津300400)

妊娠期糖尿病(GDM)是产科常见并发症之一[1]。流行病学研究显示，我国GDM发病率约为2.5%；且随着妊娠年龄的增高，其发病率明显升高[2,3]。GDM孕妇妊娠相关并发症的发生风险及其胎儿死亡风险显著增加。因此，预防和降低GDM的发生对提高我国出生人口质量，降低孕产妇并发症和死亡风险有重要意义[4]。然而，GDM发生的确切分子机制目前仍不完全清楚，其危险因素包括肥胖、高龄妊娠、糖尿病家族史等[5～8]。近年随着分子生物学技术的不断发展，从分子水平探讨GDM的发病机制并对高危人群进行筛查和干预，成为降低GDM发生率的关键。2019年2～6月，本研究采用生物信息学筛选GDM患者差异表达基因，探讨差异表达基因的生物学功能、在GDM发生中的信号通路及可能机制。

1 材料与方法

1.1 数据库选择 选取Gene Expression Omnibus(GEO)数据库、蛋白-蛋白相互作用(PPI)数据库STRING，生物信息学注释数据库(DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)进行研究。

1.2 差异表达基因筛选 在GEO数据库中筛选GDM相关表达谱芯片数据集，检索时间为自建库至2019年6月，检索条件为“Gestational diabetes mellitus”，物种选择“human”。应用GEO数据在线分析功能比较GDM组(确诊为GDM的单胎孕产妇)与对照组(无GDM的的单胎孕产妇)基因表达，并下载原始数据，筛查差异表达基因，筛选条件为P<0.05且|Log10FC|>1.5并绘制火山图分析差异基因分布。同时对多个基因表达芯片数据集进行分析，选取共差异表达的基因作为重点研究对象并绘制Venn图。

1.3 基因功能与信号通路分析 采用基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEEG进行)分析。将筛选出的差异表达基因上传DAVID数据库，进行GO与KEEG功能富集。GO包含生物学过程、细胞成分、分子功能三个层次，主要对差异表达基因进行定位，对分子生物学功能及可能的生物学过程进行分析。KEEG主要针对差异表达基因的信号通路进行功能富集，同时绘制基因本体轮的气泡图。

1.4 PPI分析 将筛选出的差异表达基因上传蛋白-蛋白相互作用数据库(STRING)，进行PPI分析，探讨差异表达基因之间的相互作用，PPI网络构建条件：数据来源于实验数据、共表达数据和融合基因，蛋白间相互作用系数>0.4。

1.5 关键基因筛选 应用基因分析软件cyotscape 中的cytohubba插件对差异表达基因蛋白相互作用网络中的关键基因进行筛选，选择前5个关键基因。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件差异表达基因筛选，采用GEO在线分析工具(GEO2R)进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异表达基因筛选 选取2个GDM相关基因表达数据集GSE51546(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi acc=GSE51546)、GSE87295(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi)。在2个数据集中，筛选了7个共差异表达基因，分别为CD34、TACSTD2、LDB2、CLDN5、NTN4、COLEC12、IGFBP6。

2.2 基因功能 7个共差异表达基因分子功能主要为细胞外蛋白结合、层黏连蛋白结合、胰岛素生长因子受体结合等；生物学过程主要富集于细胞迁移、胰岛素生长因子受体信号通路和细胞黏附等。上述基因编码蛋白主要定位于层黏连蛋白复合体、细胞外基质和基质膜等。

2.3 信号通路 上述基因主要信号通路富集于PI3K-AKT信号通路、糖代谢信号通路、神经系胰岛素抵抗相关信号通路等，见表1。

表1 GDM患者共差异表达基因的相关信号通路

2.4 PPI相互作用网络 PPI相互作用网络共有47个蛋白node，209个相互作用联系，平均每个蛋白相互作用关系为8.89，区域聚类指数为0.729，蛋白相互作用富集差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 关键基因筛选 根据GDM共差异表达基因的PPI相互作用网络图采用cytohubba进行网络关键基因筛选，结果INS、IGF1、IGF2、IGFBP3、IGF1R为PPI网络中的关键基因。

2.6 层次聚类 对筛选出的7个共差异表达基因进行层次聚类分析显示，7个基因在GDM组与对照组中呈现明显的聚类。

3 讨论

GDM是临床较为常见的一类妊娠相关并发症，其确切发病机制目前仍不十分清楚。但随着分子生物学机制的深入研究发现，GDM可能是多基因参与的代谢性疾病。因此，筛选并分析GDM差异表达基因、相关生物学功能及信号通路，对于GDM高危人群的鉴别、GDM预防及治疗具有重要意义。

本研究采用生物信息学分析方法探讨了GDM差异表达基因、其生物学功能及其在GDM发生中的信号通路、可能机制。在2个GDM相关基因表达数据集GSE51546和GSE87295中筛选出共差异表达基因7个，分别为CD34、TACSTD2、LDB2、CLDN5、NTN4、COLEC12及IGFBP6。这7个共差异表达基因可能与GDM的发生有关。进一步功能分析显示，7个共差异表达基因主要的分子功能为胰岛素生长因子调节剂，而相关信号通路主要富集于PI3K-AKT信号通路、糖代谢信号通路、神经系胰岛素抵抗相关信号通路等。相关分子功能及信号通路均与糖代谢和胰岛素代谢有关，说明上述7个共差异表达基因可能通过糖和胰岛素代谢通路影响GDM的发生。同时，对7个共差异表达基因编码蛋白构建了PPI网络，INS、IGF1、IGF2、IGFBP3、IGF1R基因为PPI网络中的关键基因，可能在GDM发病机制中发挥重要作用。INS基因为胰岛素基因，在GDM患者中存在差异表达，可能是引起GDM患者血糖升高的重要原因。IGF、IGFBP3和IGF1R分别为胰岛素生长因子、胰岛素生长因子结合蛋白及胰岛素生长因子受体。上述基因编码蛋白均与体内胰岛素水平有关，其差异表达导致体内胰岛素-血糖代谢异常，从而引发GDM。

GDM患病率逐年增加，可引起巨大儿、胎儿窘迫、胎儿畸形、死胎[9～11]，还可使剖宫产率增加等[12]。治疗的关键是控制孕妇血糖水平，病情较重或血糖控制不良的孕妇，母婴的近远期并发症发生率较高[13,14]。因此，筛选GDM发病关键基因，并对其发生的分子机制进行研究，从而筛选GDM高危人群，并进行有效干预，是降低GDM发病率和相关并发症的重要方法。

综上所述，本研究筛选出7个GDM发病相关基因，并鉴定出5个GDM发生网络中的关键基因。上述基因在GDM发生发展中可能发挥重要作用，并可能作为GDM发生的分子标志物，为GDM靶向药物的开发提供潜在靶点。