3种拟除虫菊酯对仿刺参幼参的急性毒性研究

陶腾州，李秉钧，赵 业，王昕宇

(烟台大学 海洋学院，山东 烟台 264005 )

拟除虫菊酯类农药是由除虫菊酯合成的新型第三代农药，作为一类高效、广谱、低毒的杀虫剂，目前己广泛应用于农业灭害及水产养殖中[1-2]，是传统有机磷、有机氯等水产杀虫剂的理想替代品。近年来，拟除虫菊酯类农药的大量使用导致残留农药通过地表径流、雨水冲刷、生活废水等途径进入水环境，这直接或间接地破坏了近海养殖水环境，并对其中水生生物的生存造成严重威胁[3-5]，因此有必要开展拟除虫菊酯对水生生物的毒性研究。

仿刺参(Apostichopusjaponicus)属棘皮动物门、刺参科、仿刺参属，是一种营底栖、碎屑食性的温带海洋性物种[6-7]。由于自然分布和地理环境限制，北方仿刺参养殖主要分布于山东、河北、辽宁等地沿海[8]，相关研究表明，在黄渤海海区沉积物中存在拟除虫菊酯残留[9]，其中溴氰菊酯(106.6 μg/kg)、氯氰菊酯(87.7 μg/kg)，会对海域内仿刺参生存造成潜在威胁。目前国内外有关仿刺参毒性的研究主要集中于重金属、抗生素、有机磷等方面[10-12]，而拟除虫菊酯对仿刺参的毒性效应研究却鲜有报道。本试验以重要的海水养殖物种仿刺参幼参作为研究对象，探讨3种拟除虫菊酯(溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯)对仿刺参的急性毒性效应，确定3种拟除虫菊酯对仿刺参的安全用量和毒性等级，旨在为科学的评估仿刺参养殖环境提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验药剂

试验仿刺参幼参平均体质量(2.03±0.42) g，平均体长(3.16±0.62) cm，购自烟台某育苗场，为人工繁殖饲养6月龄的幼参。幼参在室内50 L塑料箱内暂养7 d，暂养期间日换水1次，隔日投喂饵料1次。试验开始1 d前停止投喂饵料，随机分组用于试验。

溴氰菊酯乳液由拜耳杭州作物科学有限公司生产,质量浓度为25 g/L。试验所用氯氰菊酯、氰戊菊酯均由南京罗迈美试剂公司提供，纯度均为96%，先以丙酮配成质量浓度为100 mg/L的母液，使用时稀释至所需质量浓度，每24 h更新1次试验药液。

1.2 试验海水

试验用海水取自烟台近海，经砂滤除杂质，pH 7.47，溶解氧水平7.56 mg/L，盐度31.65，水温20.2 ℃，置于消毒玻璃缸中待用。

1.3 急性毒性试验方法

1.3.1 试验梯度设置

参照《水生生物检测手册》中半静水毒性试验法[13]，根据预试验所得质量浓度范围，采用等对数间距法计算设置仿刺参幼参急性试验的质量浓度梯度(溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯的预设质量浓度梯度分别为0.07、0.10、0.14、0.21、0.30 mg/L，0.55、0.68、0.85、1.05、1.30 mg/L，0.75、0.98、1.27、1.65、2.15 mg/L)。每组药物质量浓度设置3个平行组，并添加一组空白对照组[其中氯氰菊酯和氰戊菊酯增设丙酮(助溶剂体积比为2‰)对照组]，其他试验条件与毒性处理组完全一致。

1.3.2 试验管理

在室温静水条件下，在3 L玻璃烧杯中进行急性毒性试验，每组烧杯中养殖水体为3 L并放入暂养幼参10头。试验期间不投喂不充气，保持水温为19.5～21.5 ℃，每隔24 h全量换水1次，保持各组拟除虫菊酯质量浓度与原始预设质量浓度一致，并对烧杯进行保鲜膜密封处理。试验期间每隔4 h(夜间除外)观察1次幼参状态并记录挂壁个数和死亡个数(幼参死亡的判定以沉入烧杯底部、管足无吸附能力、对轻微刺激无反应、放入自然海水不能复活为准[14])，及时清除死亡个体保证水质免受污染。

1.3.3 数据统计与计算

各试验组取3个平行组的平均值计算死亡率和附壁率。其中死亡率按下式进行校正：

P=(P′-C)/(100-C)

式中，P为经校正后的试验组的死亡率(%)，C为对照组死亡率(%)，P′为试验组取平行组平均值的死亡率(%)。

附壁率是用来评价幼参附着能力和活动情况的参数，按下式计算：

AR=NA/10×100%

式中，AR为附壁率(%)，NA为附着在烧杯壁上的幼参

数(头)。

采用SPSS 18.0软件Probit回归分析，用概率单位法做出质量浓度对数—概率单位线性方程，并计算出3种拟除虫菊酯药物对幼参的24、48、72、96 h的半致死质量浓度(LC50)及95%置信区间。安全质量浓度(SC)按下式计算[15]：

SC=96 h LC50×0.1

2 结 果

2.1 3种拟除虫菊酯对仿刺参幼参死亡率的影响

在3种拟除虫菊酯药物对仿刺参幼参急性毒性试验过程中，空白对照组和助溶剂对照组幼参均未出现死亡；通过试验数据分析，得到各时间段质量浓度对数与概率单位的回归方程(表1)，并计算出3种药物作用下仿刺参幼参的半致死质量浓度及相应95%置信区间(表1)。其中，溴氰菊酯、氯氰菊酯、及氰戊菊酯对仿刺参幼参的96 h半致死质量浓度分别为0.110、0.787、1.189 mg/L，表明3种拟除虫菊酯对仿刺参幼参的毒性存在较大差异。同时，不同质量浓度拟除虫菊酯下幼参的死亡呈现出不同的模式(图1),如溴氰菊酯组，中低质量浓度(0.05～0.08 mg/L)处理组幼参的死亡个数较少，而高质量浓度(0.12～0.30 mg/L)处理组死亡率迅速增加(图1a)；氯氰菊酯试验组，48 h时各药物质量浓度中幼参死亡率相比24 h增加较大(图1b)。根据96 h半致死质量浓度，计算出3种拟除虫菊酯对仿刺参幼参的安全质量浓度分别为0.011、0.079、0.119 mg/L，根据OECD1992年的化合物对水生生物毒性分级标准[16]可知，溴氰菊酯和氯氰菊酯对仿刺参幼参的毒性分级为极毒，氰戊菊酯对仿刺参幼参的毒性分级为高毒。

表1 3种拟除虫菊酯对仿刺参幼参急性毒性作用及安全质量浓度分析

注：回归方程中，x表示质量浓度(mg/L)的对数，y表示死亡率(%).

图1 3种不同质量浓度拟除虫菊酯处理下仿刺参幼参的死亡率

2.2 3种拟除虫菊酯对仿刺参幼参附壁率的影响

与死亡率相似，幼参附壁率随处理时间和拟除虫菊酯质量浓度增大而降低(图2)。试验期间，对照组仿刺参附壁率为96%～100%，变化不大，而不同药物处理下的附壁率则呈现差异表现。在氯氰菊酯中(图2b)，附壁率在24 h后下降缓慢，而在48 h后均出现明显下降；在氰戊菊酯中(图2c)，附壁率在中低质量浓度组(0.75～0.98 mg/L)中下降缓慢，而高质量浓度组药物(1.27～2.51 mg/L)处理后明显下降。

图2 3种不同质量浓度拟除虫菊酯处理下仿刺参幼参的附壁率

2.3 3种拟除虫菊酯对仿刺参幼参的中毒症状和死亡状态的影响

不同种类拟除虫菊酯胁迫情况下的幼参的中毒症状和死亡特征呈现一定的相似和差异表现(表2)。受试幼参在接触3种药物以后，在药物刺激下出现了不同程度吐肠现象，且幼参在死亡后身体呈僵硬状态。溴氰菊酯和氯氰菊酯试验组受试幼参在接触药物后，存在较严重幼参吐肠情况，数量随质量浓度增大呈上升趋势，且在死亡幼参皮肤表面存在化皮现象；氰戊菊酯试验组仿刺参幼参在受药物刺激后只在高质量浓度组(1.27～2.51 mg/L)存在轻微吐肠情况，死亡幼参皮肤表面未见明显化皮。

表2 不同种类拟除虫菊酯处理下仿刺参幼参中毒症状及死亡特征

3 讨 论

3.1 3种药物对仿刺参幼参的毒性评价

3.1.1 溴氰菊酯

3种拟除虫菊酯中溴氰菊酯对仿刺参幼参的毒性最强，96 h半致死质量浓度为0.110 mg/L，根据水生生物毒性分级为极毒物质。现有研究中溴氰菊酯对鱼、虾、贝类的毒性研究较为全面，且发现其对不同种类生物的毒性效应存在较大差异。Koprucu等[17]报道了溴氰菊酯对鲤鱼(Cyprinuscarpio)的96 h半致死质量浓度为0.213 μg/L；吴楠等[18-19]研究表明，溴氰菊酯对克氏原螯虾(Procambarusclarkii)的肌细胞和中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)的血细胞DNA造成损伤；钟硕良等[20]报道，溴氰菊酯对文蛤(Meretrixmeretrix)和菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的96 h半致死质量浓度分别为0.27 mg/L和0.06 mg/L。对比上述研究结果发现，溴氰菊酯对甲壳类、鱼类的毒性较强，对仿刺参等无脊椎动物次之，对软体动物的影响较低。

3.1.2 氯氰菊酯

氯氰菊酯对仿刺参幼参的毒性较溴氰菊酯弱，96 h半致死质量浓度为0.787 mg/L，根据水生生物毒性分级，为极毒物质。相比于其他水生生物而言，仿刺参对氯氰菊酯的敏感程度较低。Das等[21]对南亚野鲮(Labeorohita)进行氯氰菊酯的急性毒性试验，得出96 h半致死质量浓度为0.14 mg/L；谭晓珍等[22]研究发现，氯氰菊酯对栉孔扇贝(Chlamysfarreri) 96 h半致死质量浓度为0.24 mg/L；Burredge等[23]对美洲螯龙虾(Homarusamericanus)成体使用氯氰菊酯胁迫后,得到其96 h半致死质量浓度为0.04 μg/L。本试验中氯氰菊酯对仿刺参幼参96 h半致死质量浓度为0.787 mg/L，可见不同种类动物对氯氰菊酯的敏感性是不同的，一般为虾类>鱼类>贝类，仿刺参幼参对氯氰菊酯的敏感性低于其他水生生物。

3.1.3 氰戊菊酯

与上述两种药物相比，氰戊菊酯对仿刺参幼参的毒性最弱，96 h半致死质量浓度为1.189 mg/L，根据水生生物毒性分级，为高毒物质。与其他水生生物相比，仿刺参幼参对氰戊菊酯的敏感程度较低。吴琴瑟等[24]报道了氰戊菊酯对几种对虾的毒性试验，发现氰戊菊酯质量浓度为0.6 mg/L时，所有虾类在85 min内全部死亡；蒋金花等[25]研究发现，氰戊菊酯对斑马鱼(Daniorerio)仔鱼、幼鱼和成鱼的96 h半致死质量浓度分别为3.40、18.30、4.87 μg/L；谭晓珍等[22]的研究表明，氰戊菊酯对栉孔扇贝的96 h半致死质量浓度为1.742 mg/L。本试验中，氰戊菊酯对仿刺参幼参的96 h半致死质量浓度为1.189 mg/L，对比发现，氰戊菊酯对虾类和鱼类的毒性要远大于对以仿刺参和贝类为代表的无脊椎动物。

3.2 仿刺参幼参死亡状态分析

本试验选取了3种实际生产中应用广泛的拟除虫菊酯作为试验药物[26]，以海洋无脊椎动物的代表性经济物种仿刺参作为受试动物。由于生物早期发育阶段是对药物胁迫最为敏感的阶段，因此本试验选取6月龄的仿刺参幼参作为受试对象。试验过程中发现，3种拟除虫菊酯类药物导致幼参死亡后身体均会呈现僵硬状态。拟除虫菊酯类药物作为一种神经毒剂[27]，可作用于神经膜钠离子通道，干扰神经传导[28]，造成肌肉的持续收缩，推测这是造成仿刺参幼参死亡后身体呈僵硬状态的原因之一。相关研究表明，拟除虫菊酯类药物能抑制鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)鳃组织中的Na+/K+-ATP酶活性[29]，从而导致其鳃上皮细胞脱落死亡等症状，这一现象与本试验溴氰菊酯和氯氰菊酯组受试幼参死亡后出现的化皮症状相似，而氰戊菊酯试验组中死亡幼参未见明显化皮。仿刺参幼参对这3种不同类型拟除虫菊酯的响应模式很可能与其致毒作用机制不同有关，具体原因有待后续试验深入研究。

本研究采用的急性毒性试验只能反映药物对于受试动物死亡情况的影响，无法全面反映药物的其他毒性特征，因此需进一步开展拟除虫菊酯对仿刺参的致毒机制研究。结合近年来黄渤海海岸带沉积物中的拟除虫菊酯调查数据[8]，对比本试验结果中溴氰菊酯和氯氰菊酯的半致死质量浓度，发现黄渤海沉积物中的2种拟除虫菊酯残留对仿刺参幼参暂时没有明显毒性作用。在自然海水环境中，其他环境因素(如重金属、营养盐)的存在均可能影响拟除虫菊酯药物的生物毒性，各成分之间可能存在拮抗、叠加或协同作用，因此拟除虫菊酯与其他环境污染物的联合毒性有必要进一步研究探索。

4 结 论

(1) 3种拟除虫菊酯对仿刺参幼参96 h半致死质量浓度分别为0.110 mg/L(溴氰菊酯)、0.787 mg/L(氯氰菊酯)、1.189 mg/L(氰戊菊酯)。

(2) 3种拟除虫菊酯药物对仿刺参幼参的毒性效应存在差异，毒性依次为溴氰菊酯>氯氰菊酯>氰戊菊酯。

(3) 3种拟除虫菊酯对仿刺参幼参的安全质量浓度分别为0.011 mg/L(溴氰菊酯)、0.079 mg/L(氯氰菊酯)、0.119 mg/L(氰戊菊酯)，按照水生生物毒性分级，溴氰菊酯和氯氰菊酯对仿刺参幼参为极毒物质，氰戊菊酯对仿刺参幼参为高毒物质。