糖蜜对草鱼混养池塘水质和细菌群落结构的影响

2019-09-18郭小泽唐艳强侯玉洁刘文舒陈彦良肖海红李思明

水产科学 2019年5期

郭小泽，唐艳强，侯玉洁，刘文舒，陈彦良，方刘，肖海红，李思明

( 1.江西省农业科学院畜牧兽医研究所，江西南昌 330200； 2.南昌市农业科学院，江西南昌 330008；3.长江大学动物科学学院，湖北荆州 434023 )

随着我国水产养殖业规模化、集约化的发展，养殖水体的水质处理技术成为水产养殖业研究的热点。研究表明，水产养殖动物只能有效吸收投喂饲料中蛋白质的20%～25%，其余部分则以残饵、氨氮和粪便的形式排放到养殖水体中[1]。在高温季节，随着人工饲料投喂量的增加，养殖水体中氨氮、亚硝酸盐氮的含量会逐渐升高，从而导致养殖动物发病或死亡[2]。因此，集约化养殖条件下，有效解决养殖水体水质问题成为水产养殖业健康发展的重要因素之一。

生物絮团技术(BFT)是通过在养殖系统中培育和调控微生物群落来促进养殖动物健康生长，是一种将水处理系统和养殖生长系统有机结合的新型人工综合生态技术[3]。该技术通过微生物群落吸收、转化水体中的氮磷代谢废物，达到维持水体水质稳定的作用。同时，形成的生物絮团可作为部分养殖动物的天然饵料，节约了养殖成本。该技术的核心是通过调节水体的C/N来控制生物絮团的形成， Avnimelech[4]通过建立假设模型，根据微生物自身蛋白合成对C/N需求，计算得出饲料中C/N为15.75∶1时有利于异养菌的繁殖，可有效降低水体中氨氮和亚硝酸盐氮含量。随后，C/N对罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)[5]、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[6]、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[7]、鲫鱼(Carassiusauratus)[8]等养殖水质的影响及生物絮团调控方面的研究均有报道。

目前，生物絮团技术在集约化水产养殖中作为一种改善养殖水体环境的手段得到了广泛的研究和应用，但该技术的研究更多集中于虾和罗非鱼等单一养殖模式中，对其在混养模式及其水体中细菌群落结构的研究还较少。笔者利用细菌16S rRNA测序技术，分析通过投放糖蜜调控水体C/N水平对草鱼(Ctenopharyngodonidellus)混养池塘水体细菌群落结构的影响，以期从水体微生物角度为C/N调控养殖水体水质技术提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验设置3个不同处理组，每组3个平行，各处理组通过添加糖蜜调控C/N水平，分别为15∶1、20∶1、25∶1，以不投放糖蜜组为对照组(C/N为10∶1)。根据文献[4]总结的生物絮团养殖系统的C/N调控公式，及饲料投喂量调整不同处理组糖蜜的添加量。糖蜜添加量按下式计算：

C/N=(m1×ρ1+m2×ρ2)/(m2×ρ3)

式中，m1为糖蜜添加量，ρ1为糖蜜中有机碳含量，m2为饲料投喂量，ρ2为饲料中有机碳含量，ρ3为饲料中氮含量。

试验于12个25 m×25 m×2 m水泥护坡池塘中进行。每个池塘放养850尾草鱼，体质量为(320.4±2.5) g；彭泽鲫(C.auratusvar.pengze)200尾，体质量为(45.3±1.2) g；鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)100尾，体质量为(86.7±4.3) g；鳙鱼(Aristichthysnobilis)50尾，体质量为(98.4±4.8) g。上述鱼苗均由九江市水产科学研究所提供。

1.2 试验管理

试验于2017年7月5日—10月5日在九江市水产科学研究所试验基地进行。每日投喂饲料3次，分别为8:00—8:30、12:00—12:30和16:00—16:30，所有试验使用粗蛋白含量为30%的草鱼混养饲料(江西海大饲料有限公司)，每日定量投饲，日投量约为草鱼体质量的3%，每周根据摄食和生长情况作适当调整。试验期间所有池塘不换水，只补充因渗漏和蒸发而损失的水量，使水位维持在约1.5 m。同时，每日1:00—5:00及晴天13:00—15:00打开增氧机，并根据天气情况调整。每次投喂饲料后1 h，将糖蜜与少量池塘水适时在桶中搅拌混合，全池均匀泼洒。

1.3 样品采集与检测

1.3.1 水质检测

每月上旬选择晴天，于10:00用采水器在池塘四周及中心5个固定点水深0.5 m处分别采集1 L水样混合，置于无菌聚乙烯瓶中静置30 min后，经800目筛绢过滤，冷藏带回实验室立即进行水质指标检测。使用YSI-QS600水质监测仪现场检测水体的溶解氧和pH；水体中的氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、总氮、总磷测定参照《水和废水监测分析法》[9]进行。其中，氨氮质量浓度测定采用纳氏试剂分光光度法，硝酸盐氮质量浓度测定采用萘乙二胺分光光度法，硝酸盐氮质量浓度测定采用紫外分光光度法，总氮和总磷采用过硫酸钾氧化法检测。

1.3.2 生物絮团指标的测定

生物絮团沉积量测定采用文献[10]的方法，使用沉淀漏斗(1000-0010，Nalgene)取1 L水样经过30 min的沉淀，统计生物絮团沉积量；总固体颗粒悬浮物测定采用CJ/T 52—1999《城市污水悬浮固体的测定》，取水样1 L，使用TOYO定量滤纸抽滤，于105 ℃烘箱烘干后称量质量。

1.3.3 水体细菌群落结构检测

根据前期水质检测结果，选取最佳糖蜜添加组和对照组进行水体中微生物菌群检测。用采水器在水质取样固定点采水3 L，经过0.22 μm的滤膜真空抽滤后，将滤膜置于无菌EP管中，并放置液氮中速冻，用于细菌DNA提取。细菌DNA提取使用土壤基因组DNA提取试剂盒(OMEGA，美国)进行。在超净工作台中，将采样获取的滤膜置于5 mL无菌EP离心管中，用灭菌后的剪刀将滤膜尽量剪碎，加入2.5 mL的 Buffer SLX Mlus。参照DNA提取试剂盒说明书进行操作提取DNA，将提取到的样品DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

将检测合格的细菌DNA进行PCR扩增，扩增引物根据细菌16S rRNA的V3～V4区设计引物U341F/U806R。具体序列为：U341F，5′-CGGCAACGAGCGCAACCC-3′；U806R，5′-CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC-3′。扩增产物经检测合格后进行纯化及测序文库构建，测序服务由北京诺禾致源科技股份有限公司提供。测序结果经过拼接、过滤得到Clean Tags，再经过嵌合体的去除得到有效数据,根据特定的阀值(97%)进行可操作分类单元聚类，并结合微生物数据库——SILVA进行物种注释和物种分类分析。

1.4 数据分析

测序结果的可操作分类单元聚类采用RDP classifier贝叶斯算法；利用Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数计算细菌生态多样性指数；主成分分析利用R 3.1.0软件进行。利用SPSS 19软件对数据进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 泼洒糖蜜对草鱼混养池塘水质指标的影响

泼洒糖蜜对草鱼混养池塘水质指标的影响见表1。在试验前期(7月)，各组的水质指标无显著差异(P>0.05)。随着试验进行，泼洒糖蜜组的池塘水体中溶解氧水平较对照组有降低趋势，尤其是C/N 20∶1组和C/N 25∶1组与对照组差异显著(P<0.05)。各组池塘水体中总磷含量随着试验进行均逐渐升高，泼洒糖蜜组与对照组无显著差异(P>0.05)。泼洒糖蜜后，水体中氮元素的变化主要表现为氨氮、亚硝酸盐氮的含量下降，硝酸盐氮的含量升高，其中C/N 20∶1组与对照组差异显著(P<0.05)。

表1 泼洒糖蜜对草鱼混养池塘水体水质指标的影响

注：同列中字母不同的平均值差异显著(P<0.05)，下同.

2.2 泼洒糖蜜对草鱼混养池塘生物絮团形成的影响

草鱼混养池塘中泼洒糖蜜可显著促进生物絮团的形成。在试验前期(7月)，各组生物絮团沉积量和总固体颗粒悬浮物量无显著差异(P>0.05)(图1、图2)。试验组生物絮团沉积量和总固体颗粒悬浮物量随糖蜜泼洒量的增加而升高，并且在8月达到最大值，随后9月和10月开始降低，而对照组则无显著变化。其中，8月、9月和10月C/N 20∶1组和C/N 25∶1组的生物絮团沉积量与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)；泼洒糖蜜的池塘水体中总固体颗粒悬浮物量在8月、9月和10月均显著高于对照组(P<0.05)。

图1 泼洒糖蜜对草鱼混养池塘水体中生物絮团沉积量的影响

图2 泼洒糖蜜对草鱼混养池塘水体中总固体颗粒悬浮物量的影响

2.3 泼洒糖蜜对草鱼混养池塘细菌群落多样性的影响

根据水质指标检测结果，分别选取对照组和C/N 20∶1组进行水体细菌群落分析，结果见表2。通过测序后对各样品的有效序列进行系谱分类，以97%相似性水平为标准划分可操作分类单元，对照组-1、对照组-2、对照组-3组和C/N 20∶1-1、C/N 20∶1-2、C/N 20∶1-3组样品数据分别可划分为7210、7310、7636和6056、6369、5698个可操作分类单元。通过在同一样本中检测到的随机选择扩增子序列的覆盖率评估抽样的完整性发现，可操作分类单元的覆盖率为93.23%～96.75%。根据样品多样性指数(Shannon指数和Simpson指数)可知，泼洒糖蜜组的草鱼混养池塘水体中微生物多样性高于对照组。然而，Chao1指数表明，泼洒糖蜜组草鱼混养池塘水体菌群的丰度与对照组相比有所下降。

表2 各样品多样性指数

2.4 泼洒糖蜜对草鱼混养池塘菌群结构的影响

通过对有效序列进行系谱分类，统计各个样品中重要的细菌门类及其相对丰度，共获得10个重要菌门(表3)，分别为蓝细菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、梭杆菌门、绿菌门、糖杆菌门、厚壁菌门、酸杆菌门。统计结果表明，在门类水平上，C/N 20∶1组和对照组水体微生物中优势菌门为蓝细菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门。其中，对照组蓝细菌门相对丰度(32.34%～38.71%)高于C/N 20∶1组(20.17%～24.77%)，而C/N 20∶1组放线菌门(14.29%～17.01%)、绿弯菌门(4.33%～6.19%)和厚壁菌门(1.15%～1.48%)的相对丰度均高于对照组[放线菌门(7.84%～10.01%)、绿弯菌门(1.24%～1.75%)、厚壁菌门(0.18%～0.44%)]。

对筛选出的相对丰度较高的前10种微生物群落进行属水平菌群结构及分布统计分析，对照组和C/N 20∶1组水体中的优势菌属均为聚球藻属(Synechococcus)、CL500_29_marine_group和hgcI_clade(图3)，但各优势菌属的相对丰度在不同组中变化却不同。与对照组相比，C/N 20∶1组的聚球藻属丰度有明显的降低，而CL500_29_marine_group和hgcI_clade菌属的丰度则明显升高。

表3 草鱼池塘水体中优势细菌门类及相对丰度 %

图3 样品中优势菌属及其相对丰度

2.5 样品聚类分析

通过对样品进行主成分分析(图4)发现，对照组和C/N 20∶1组的样品分布在不同区域，说明在草鱼混养池塘中泼洒糖蜜可有效改变水体中细菌群落的主成分。同时，为了研究样品间的相似性，对样品进行聚类分析(图5)，构建样品的聚类树发现，对照组3个样品和C/N 20∶1组3个样品各自聚为一支，说明样品的相似性较为接近。

图4 细菌群落的主成分分析

图5 样品聚类树

3 讨论

3.1 泼洒糖蜜对草鱼混养池塘水质指标的影响

Avbimelech[4]提出了水产养殖系统中的C/N对水质调控的生物絮团反应机制理论，并在实际应用中有效降低了养殖水体中的氨氮及亚硝酸氮的含量。本研究以糖蜜为碳源调控草鱼混养池塘水体中的C/N，结果表明，C/N为20∶1时对水体氨氮、亚硝酸盐氮的含量降低效果最佳，说明草鱼混养池塘水体C/N为20∶1时更适宜生物絮团异养细菌的生长繁殖，而C/N低于或高于这个比例则会抑制其生长繁殖，这与在养殖罗氏沼虾池塘中泼洒糖蜜的试验结果一致[11]。然而，王金林等[12]以葡萄糖为碳源调控草鱼养殖水体的C/N，结果发现，C/N为25∶1时对水体氨氮、亚硝酸盐氮的含量降低有显著效果。这一差异可能与试验所用碳源、草鱼放养模式等因素有关，因为不同的碳源对水体生物絮团的营养成分、微生物菌群组成有影响[13]。

本研究结果发现，随着水体中C/N逐渐升高，水体的溶解氧含量反而降低，这一现象在罗非鱼[14]和凡纳滨对虾[15]的试验中也有报道。溶解氧含量降低可能是由水体的生物絮团中异养细菌数量增加及积累的有机物增加而耗氧量增大所致[16]。因此，在应用生物絮团技术的过程中需要充分的曝气，充足的氧气有利于异养细菌的聚集，加速生物絮团的形成。同时，持续的曝气可使絮团悬浮于水体中，有利于缓解絮团的沉淀[17]。

3.2 泼洒糖蜜对草鱼混养池塘细菌群落多样性的影响

环境中细菌群落多样性是群落稳定性的重要衡量指标，菌群组成越复杂，说明菌群应对外部环境变化和群落内部种群波动的缓冲能力就越强，群落结构就越稳定。本研究中，以Shannon指数和Simpson指数为指标衡量水体中细菌群落多样性。结果表明，泼洒糖蜜可提高草鱼混养池塘细菌群落的多样性。这与在虾蟹混养系统中添加糖蜜对水体细菌群落多样性的研究结果相似[18]。同时，有研究表明，当水体中C/N水平过高时，可能会抑制水体中敏感细菌的生长和繁殖，造成菌群多样性降低[19]。本研究只检测了C/N为20∶1时菌群多样性的变化，故无法确定是否C/N水平升高会导致草鱼混养池塘水体中菌群多样性下降，这还需进一步的研究。

3.3 泼洒糖蜜对草鱼混养池塘菌群结构组成的影响

细菌在养殖水体中物质和能量循环及转化过程中具有重要的作用，细菌群落结构决定了水体环境生态功能的特性。本研究发现，草鱼混养池塘水体中优势菌群主要有蓝细菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门，这与李建柱等[20]对草鱼养殖池塘水体中菌群检测结果基本一致。然而，王金林等[12]研究发现，草鱼养殖水体中优势菌群仅有变形菌、放线菌和拟杆菌。这一差异可能与养殖池塘、养殖鱼类放养种类、检测水样季节及水样采水位置等因素有关[21]。

本研究结果表明，泼洒糖蜜对草鱼混养池塘水体中细菌群落结构有显著的影响。蓝细菌又称蓝藻，是一种分布广泛的、古老的原核生物类型，在全球的碳氮循环中扮演着重要的角色[22]。在养殖池塘中，水华蓝藻会通过释放藻毒素对养殖生物造成伤害，还会对池塘生态系统微生态环境造成影响[23]。本研究中泼洒糖蜜的池塘水体中蓝细菌门的相对丰度与对照组池塘相比有降低，说明通过C/N调节可有效控制草鱼混养池塘水体中蓝细菌的丰度。同时，本研究发现，泼洒糖蜜后，草鱼混养池塘水体中放线菌门和绿弯菌门相对丰度升高。放线菌是一类广泛分布于自然界的特殊菌种类型，因产生丰富的活性次生代谢产物(如抗生素、维生素和酶)而著名，其大量生长繁殖，能改善水体气味并对水体有消毒作用，对病原微生物特别是对抑制腐败细菌的生长繁殖有抑制作用，同时还具有转化氮、磷等元素的功能[24]。绿弯菌是工厂废水中常见的细菌，与化学耗氧量的去除有很好的相关性[25]。在优势菌属方面，本研究发现，泼洒糖蜜后草鱼混养池塘水体中CL500_29_marine_group和hgcI_clade菌属的丰度与对照组相比有一定比例的升高。有研究表明，hgcI_clade具有很强的吸收碳水化合物和富氮化合物的遗传能力，并耐受较低溶解氧水平，还可利用低温中的低含量的溶解有机碳[26]；而CL500_29_marine_group能够有效利用多种形式的碳水化合物[27]，推测CL500_29_marine_group和hgcI_clade通过促进碳循环和氮循环来改善池塘水体的水质。由此可见，在草鱼混养池塘水体中泼洒糖蜜可优化水体中细菌群落结构，有效改善水体生态环境。

3.4 泼洒糖蜜对草鱼混养池塘菌群的聚类分析

多样性的高低可以反映各群落物种组成的差异。利用距离表征出样品间的关系，通过主成分分析作图法将所有样品在二维坐标系中表现出来，从侧面反映了各个组的多样性及各样品之间的相互关系[28]，有助于分析各样品的群落组成结构。样品主成分分析表明，对照组和C/N 20∶1组的样品各组分布在一侧，说明在草鱼混养池塘中泼洒糖蜜可有效改变水体中细菌群落的主成分结构。另外，利用加权UniFrac距离建立物种系统发育树来分析微生物群落样品间的相似性[29]，结果显示，对照组和C/N 20∶1组的样品各组分别聚为一支。这进一步证明，通过泼洒糖蜜来调节水体的C/N比分别为10∶1和20∶1可有效改变草鱼混养池塘水体中微生物菌群的种类和丰度。