二氢杨梅素调节肝脏脂代谢及细胞外基质生成的作用研究

彭山珊

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）已经成为全球主要慢性病之一及我国重要的公共卫生问题，但尚缺乏理想的防治措施。在网上查询的时候，我发现了一种天然植物——莓茶，莓茶产地分布在长江流域以南，如湖北西南部、云南东南部、福建、广西、广东、湖南等地，“长寿之乡”广西巴马也盛产莓茶。网上提到莓茶的保健功能有很多，尤其声称脂肪肝患者长期饮用有明显的效果。“莓茶是否如网上所描述的那样可以缓解脂肪肝和减轻肝纤维化？”带着这个问题，我开始了本课题的研究。

膳食营养干预在慢性病防治中的重要作用已被广泛关注，特別是植物性食物在慢性疾病防治中的作用日益凸显。研究发现，一些多酚类化合物能够改善NAFLD患者肝脂肪变，抑制炎性反应，延缓NAFLD疾病进程。二氢杨梅素（DHM）又名蛇葡萄素，属于多酚类中的黄酮类化合物，在天然植物莓茶中含量甚高，在嫩茎叶中含量高达30%以上（以干重计），远远高于莓茶中其他黄酮类化合物。因此，二氢杨梅素是莓茶中的主要天然活性成分。结合国内外相关研究进展，我们率先提出了“莓茶可能防治NAFLD”的理论假说，并推测莓茶的健康功效可能主要与“二氢杨梅素改善肝脏脂质代谢和调节细胞外基质产生”有关。

为阐明这一理论假说，我们拟利用高脂诱导的动物模型，研究二氢杨梅素对NAFLD发生中脂代谢及肝纤维化的作用，并进一步通过细胞实验，研究二氢杨梅素对肝星状细胞分泌的细胞外基质的影响，并阐明腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/Smad介导的相关信号通路在其中的作用。本课题研究结果将为NAFLD防治提供新的膳食营养干预策略。@实验方法

取8周龄的雄性129野生型小鼠40只，随机分为4组，每组10只，干预持续12周。①SD组：给予基础饲料;②HFD组：给予高脂饲料;③HFD+DHM组：给予含有0.6%DHM的高脂饲料（相当于）;④DHM组：给予含有0.6%DHM的基础饲料。

利用高脂膳食诱导小鼠建立动物模型，检测二氢杨梅素（DHM）干预后对肝脏脂质沉积、血脂谱、肝脏炎症、肝纤维化发生等的影响;利用大鼠原代肝星状细胞及肝星状细胞株HSC T6，DHM干预后，CCK 8法检测细胞活力;Annexin V FITC/PI染色和流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期;免疫细胞化学法检测活化蛋白a-SMA的表达;ELISA法检测细胞外基质COL-I、COL-III、TIMP-1及MMMP-1产生水平;qRT-PCR和We.stem Blot分别检测AMPK、Smad家族蛋白及细胞外基质基因mRNA和蛋白的表达;进而利用AMPK激动剂（AICAR）和AMPK抑制剂（CompoundC）及AMPK和Smad7的siRNA干预HSC-T6细胞株，qRT-PCR和We.stem Blot法分别检测细胞外基质及相关基因mRNA和蛋白的表达。

主要实验结果

二氢杨梅素能够改善肝脏脂代谢及延缓高脂诱导的NAFLD进程

通过建立高脂诱导小鼠模型，DHM干预后能够显著抑制小鼠体重增加，减少肝脏脂肪蓄积（图1），改善血脂谱，减轻肝脏炎症损伤和抑制肝谷丙转氨酶（ALT）水平升高（图2），并能够改善肝纤维化程度（图3）。结果表明：DHM能够改善肝脏脂代谢及延缓高脂诱导的NAFLD进程。

二氢杨梅素能够显著抑制肝星状细胞活化并调节细胞外基质水平，可能与其对Smads蛋白表达的调节作用有关

利用转化生长因子TGF-β1诱导原代肝星状细胞（HSC）和HSC-T6细胞株建立细胞模型，DHM处理后能明显抑制TGF-β1诱导的原代HSC细胞和HSC-T6细胞株的增殖活化，调节细胞周期，促进细胞凋亡，降低COL-I和基质金属蛋白酶抑制物TIMP 1及增加基质金属蛋白酶MMP-1等细胞外基质的产生，降低肝星状细胞内a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）的表达。同时，DHM还能抑制TGF-β1诱导的COL-I、Smad3、Smad4的mRNA表达水平增加及MMP-1和Smad7的mRNA表达水平降低。最后DHM能抑制TGF-β1对HSC-T6细胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、Smad2/3、Smad4、Smad7蛋白表达的影响。

二氢杨梅素通过促进AMPK磷酸化及Smad7表达，进而抑制Smad4表达和Smad2/3磷酸化，最终减少TGF-β1诱导的HSC中ECM分泌和HSC活化

采用AMPK抑制剂或siRNA分别抑制或沉默AMPK表达后，DHM对TGF-β1诱导的HSC中Smad2/3磷酸化及Smad4和Smad7蛋白表达的影响被抑制;而利用AMPK激动剂AICAR预处理后，DHM能够协同AICAR促进AMPK磷酸化、减少Smad2/3的磷酸化和Smad4蛋白表达及增加Smad7蛋白表达水平。以上结果提示：AMPK在介导DHM对TGF-β1诱导HSC细胞内Smad2/3磷酸化及Smad4和Smad7表达的调节中起关键作用。利用siRNA沉默Smad7基因表达后，DHM对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞中COL-I、COL-III和TIMP-1 mRNA表达的抑制及对MMP 1 mRNA的促进作用被削弱，提示Smad7在DHM调节HSC细胞ECM的mRNA表达中起关键作用。

结论

二氢杨梅素能够调节肝脏脂代谢，减少肝脂质沉积及改善NAFLD肝纤维化，并可能通过AMPK/Smad信号通路抑制肝星状细胞活化及调节细胞外基质水平，延缓NAFLD进程。

创新性

本课题率先提出“莓茶可能具有防治NAFLD的功效”的理论假说，并通过动物实验和细胞实验发现莓茶中的主要天然活性成分二氢杨梅素具有改善肝脏脂代谢、减少肝脂质沉积及调节细胞外基质产生的作用。研究结果证实了本课题的理论假说。

本研究通过实验研究，率先发现二氢杨梅素能够改变高脂诱导动物的血脂谱，减少肝脏脂质沉积和炎性反应，延缓肝纤维化进程，并可能通过促进肝星状细胞AMPK磷酸化及Smad7表达，进而抑制Smad4表达和Smad2/3磷酸化，最终调节TGF-β1诱导的细胞外基质相关基因表达，调节细胞外基质产生。研究结果初步阐明了二氢杨梅素调节脂代谢和细胞外基质的作用机制，为其防治NAFLD提供了科学依据。

小结

二氢杨梅素是天然植物莓茶中富含的主要多酚类植物化学物，来源经济方便，人体食用安全。本课题为NAFLD人群（包括NAFLD肝纤维化患者）提供了新的膳食营养干预策略。

本课题研究为莓茶的保肝和抗纤效果提供了科学依据，同时为基于莓茶的功能性食品研发奠定了基础。

本课题初步揭示了二氢杨梅素的作用分子机制，为NAFLD防治研究提供了新的研究思路和干预靶点。