菌肥拌种对太子参生长及品质的影响

任建国 王益 刘红美

摘要：种植经多功能菌肥拌种处理的太子参种根，收获后分析太子参块根长度、生物量及主要品质指标，以研究其对太子参生长发育和品质的影响。结果表明，与未经菌肥处理的对照相比，菌肥处理过的太子参块根生物量明显增加;块根的氨基酸、皂苷含量及微量元素Mn、Fe含量分别增加243.3%、119.8%、2.1%和13.1%，而多糖、环肽含量及微量元素Cu、Zn含量差异不大。多功能菌肥的施用能改善太子参块根的品质，提高其药用价值。

关键词：太子参;菌肥;品质;生物量

中图分类号：S567.5+30.6   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）07-0116-04

太子参[Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax]为一种药食两用的中药材，含有多糖、环肽、氨基酸、皂苷、微量元素、挥发性成分等[1]，临床上用于治疗脾虚体倦、食欲不振、病后虚弱等症，而作为保健食品的有复方太子参颗粒、太子参口服液（太子宝）、什锦太子参酥脆和姜汁太子参酥等[2]。菌肥是利用微生物的生命活动及代谢产物，为农作物提供营养元素、生长物质，以达到调控生长、提高产量、改善品质、减少化肥使用量及提高土壤肥力的目的。菌肥在作物上的应用较多，尤其是禾谷类作物，如水稻[3]、小麦[4-6]、玉米[7]等，而在经济作物烟草、茶及中草药等[8]上应用较少。左群等采用L9（34）正交试验研究不同菌肥[恩益碧（NEB）母液、重茬一号和彤娇菌肥]、不同施用量和不同施用方式（拌种、拌肥和直接施肥）对连作太子参产量的影响，结果发现，菌肥的施用方式对太子参产量影响最明显，其次为施肥量[9]。陆志平用由巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）、解磷细菌（Bacillus megaterium）、钾细菌（Bacillus mucilaginosus）组成的复合菌剂增施于太子参种植中，结果发现，菌剂能够提高太子参产量，但因不同剂量基肥和追肥的施用其增产效果有所不同[10]。上述所有文献都没有关于菌肥对太子参品质影响的相关研究报道，为此本试验就自制菌肥对太子参生长、品质的影响进行相关研究，以期为菌肥在太子参种植中的推广施用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料和试剂 自制太子参菌肥（未进行菌株鉴定）：由促生菌KTS-1-1（具有抗根腐病、解鉀功能，用字母A代表）、TR-10J（具有溶磷功能）、ATS-1-1（具有固氮功能）、ATR-2-3（具有固氮功能）、PTS-2-1（具有溶磷功能）组成的菌液[11];普通复合肥：西洋复合肥（贵州西洋肥业有限公司，总养分含量≥45%，氮 ∶ 磷 ∶ 钾=13 ∶ 17 ∶ 15）;磷肥：钙镁磷（江西江磷磷肥有限公司，养分含量≥12%）;钾肥：硫酸钾（江苏邳州苏北肥料有限公司，氧化钾含量≥50%）;

试剂：人参皂苷Rbl，购自北京世纪奥科生物技术有限公司;L-亮氨酸、D-葡萄糖标准品，购自中国药品生物制品检定所;其他试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器 contrAA700型火焰原子吸收光谱仪，德国耶拿公司;R-3型旋转蒸发仪，瑞士步琦公司;721分光光度计，上海第三分析仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 菌肥施用及太子参生物性状测定 选取大小一致的健康种根作为种子进行种植，试验设置菌肥拌种（处理）和非拌种（对照）2种处理，于2016年1月在贵州省施秉县牛大场镇中药材种植基地进行。用3×108 CFU/mL菌肥液喷湿种根表面，风干后再排种。每处理3次重复，小区面积为 10 m2（10 m×1 m），共6个小区。种植条件与常规生产模式相同，施用基肥量为300 kg/hm2普通复合肥、750 kg/hm2磷肥、150 kg/hm2 钾肥。各处理用450 kg/hm2复合肥按1 kg ∶ 75 L兑水成稀肥液浇施，作为追肥。试验期间其他管理条件相同。太子参收获后，测量太子参块根长度;将块根烘干至恒质量后测其干质量。

1.2.2 块根氨基酸含量测定 太子参收获后采取不同处理小区的块根样品混合后，用重蒸水冲洗干净，室温晾干后置于60 ℃恒温干燥箱烘干至恒质量，研磨成粗粉后储存于干燥器内备用。块根氨基酸含量的测定参考文献[12]。取1.0 g块根粗粉置于25 mL大试管中，加入20 mL 95%的乙醇，密塞;将试管置于70 ℃水浴锅中保温30 min，随后取出25 mL大试管静置冷却至室温，最后定容至25 mL;将上层清液用滤纸过滤，滤液即可用于测定氨基酸含量。每个处理重复3次。

取质量浓度为0、1、5、10、15、20、25 μg/mL的亮氨酸（选取人体必须氨基酸之一的亮氨酸来表征块根中总氨基酸的相对含量）溶液 1 mL，分别加入3 mL 0.1%茚三酮试剂（0.1 g茚三酮溶于100 mL 95%乙醇溶液）及0.1 mL 0.1%抗坏血酸，于沸水中保持 15 min，用95%乙醇补足失去的体积，于580 nm处测定吸光度后绘制标准曲线。

吸取样品滤液1 mL，加入3 mL 0.1%茚三酮试剂及 0.1 mL 0.1%抗坏血酸，于沸水中保持15 min，用95%乙醇补足失去的体积，于580 nm处测定吸光度。根据样品的吸光度，从标准曲线上查得样品液氨基酸含量，然后根据下式计算块根氨基酸含量。

每克粗粉样品中氨基酸含量=（ρ×V1）/（m×D1）。其中，ρ为样品液中测得的氨基酸质量浓度，μg/mL;V1为提取液的体积，本试验为25 mL;m为粗粉质量，g;D1为粗粉中干物质含量，%。

1.2.3 块根多糖含量测定 块根多糖含量的测定参考文献[13]，稍有改动。取10 g块根粗粉，置于100 mL圆底烧瓶中，加入80 mL 80%乙醇在90 ℃下回流提取5次。药渣中加入80 mL蒸馏水在90 ℃水浴锅中提取1 h，趁热过滤，药渣加蒸馏水洗涤数次，洗液并入滤液，冷却后移入100 mL容量瓶中，最后用蒸馏水定容备用。每个处理重复3次。

取2 mL质量浓度分别为0、8、16、24、32、40 μg/mL的葡萄糖溶液于各试管中，加入1.0 mL 6%苯酚试液摇匀，再迅速滴加浓硫酸5.0 mL，摇匀后放置5 min，再在沸水浴中加热 15 min，取出冷却至室温，于490 nm处测吸光度，绘制标准曲线。

吸取供试液0.5 mL置于具塞试管中，加入蒸馏水至 2.5 mL，另取2.5 mL蒸馏水作空白对照，各管均加入1.0 mL 6%苯酚试液摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，摇匀后静置 5 min，再置于沸水浴中加热15 min，冷却至室温，于490 nm处测定吸光度，根据标准曲线可计算得供试液中葡萄糖的浓度，样品中多糖含量计算公式：多糖的含量=C×D2×f×V2÷m1×100%。其中，m1为供试块根质量，μg;C为多糖稀释液中葡萄糖的浓度，μg/mL;D2为多糖的稀释因素（常数），V2为定容体积，mL;f为换算因素，常数。

1.2.4 块根皂苷含量测定 块根皂苷提取及含量测定参考文献[14]，稍有改动。精密称取太子参粗粉2.0 g，加20 mL蒸馏水稀释，超声提取30 min，缓缓加入乙醇，使含醇量达70%;静置过夜，抽滤，减压浓缩至干，以30 mL蒸馏水溶解残渣，以60 mL水饱和的正丁醇分3次萃取，萃取液合并后再以50 mL正丁醇饱和的蒸馏水洗涤1次，减压浓缩至干，残渣以甲醇溶解并定容至10 mL，即得待测的总皂苷甲醇溶液。每个处理重复3次。

取100 ℃干燥至恒质量的人参皂苷Rbl对照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度配成标准溶液。精密吸取标准液10、20、40、80、160 μL，分别置于10 mL具塞试管中，用微热风吹去溶剂，加5%香草醛冰醋酸溶液 0.2 mL、高氯酸（70%～72%）0.8 mL，混匀后密塞。置60 ℃水浴中加热 15 min 后立即用流水冷却，加冰醋酸5 mL，摇匀，与空白对照均于560 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。

精密移取所得皂苷的甲醇溶液50 μL，置于10 mL具塞试管中，用水浴锅加热除去溶剂，加5%香草醛冰醋酸溶液 0.2 mL、高氯酸（70%～72%）0.8 mL，混匀并密塞。置60 ℃水浴中加热15 min后立即用流水冷却，加冰醋酸5 mL，摇匀，与空白对照均于560 nm波长处测定吸光度，由标准曲線可得试液中总皂苷的浓度，再计算样品中皂苷的含量。

1.2.5 块根环肽含量测定 块根环肽提取参考文献[15]，稍有改动。称取1.0 g干燥粉末样品，用50 mL甲醇超声提取45 min，过滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩至干，用甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，使用0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试样品溶液。

分别取浓度为200 μg/mL的亮氨酸标准品0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL的具塞比色管中，加入1 mL pH值为6.8的磷酸缓冲液和1 mL茚三酮显色剂（0.02 g/mL），于沸水中水浴15 min，取出置冷水中水浴15 min，加入5 mL的碘酸钾（2 g/L），用蒸馏水定容至10 mL，摇匀。在576 nm波长下测定吸光度，得到标准曲线。

环肽含量的测定参考文献[16]，稍有改动。分别吸取6个250 μL的供试样品溶液，向其中3个样品溶液中加入 4 mL 1.2 mol/L的HCl，另3个中加入等量的蒸馏水，于90 ℃水解2 h，取出后用2 mol/L的NaOH中和加HCl的溶液至pH值在5～7之间，然后用蒸馏水定容至10 mL，摇匀后取1 mL于25 mL的比色管中，加入1 mL pH值为6.8的磷缓冲酸液和1 mL茚三酮显色剂（0.02 g/mL），于沸水中水浴15 min，取出置冷水中水浴15 min，加入5 mL的碘酸钾（2 g/L），用蒸馏水定容至10 mL，在576 nm波长下测定吸光度，通过标准曲线得酸解后样品溶液中亮氨酸浓度，减去未经酸解（蒸馏水）亮氨酸浓度即可得经环肽水解释放出亮氨酸的量（间接反应环肽含量），再通过换算获得块根中环肽（亮氨酸）含量的大小。

1.2.6 块根微量元素含量测定 块根中Zn、Fe、Cu、Mn含量测定参考文献[17]，稍有改动。称取4份样品各0.100 0 g，置于50 mL烧杯中，加6 mL HNO3和2 mL H2O2放置过夜，于微波消解仪中消解，用蒸馏水清洗消解管，待冷却至室温后用蒸馏水定容至10 mL待分析用。采用标准曲线法分别测定Zn、Fe、Cu、Mn元素含量，在优化工作条件[17]下对样品进行测定。由标准曲线可得分析液中微量元素的浓度，再换算出样品中微量元素的含量。

1.3 数据统计方法

采用Excel 2007、SAS 8.1软件对本试验数据进行分析统计。

2 结果与分析

2.1 菌肥对太子参生物性状的影响

由图1可知，经菌肥拌种处理（处理）的块根平均长度与未经菌肥处理（对照）的块根平均长度差异不显著，但在单个块根干质量方面，处理显著高于对照表明，菌肥与化肥配施能增加单个块根产量，有明显的增产作用，这与张礼维等的研究结果[18-19]相似。另外，本试验结果也表明，处理与对照在单个块根质量上的差异与菌肥拌种所起的作用相关。本试验结果可为降低化学肥料污染、保证农业可持续生产提供实践方案。

2.2 菌肥对块根氨基酸含量的影响

由图2可知，处理和对照块根中氨基酸含量分别为 18.24、5.31 mg/g，处理氨基酸含量约是对照的3.4倍，显著高于对照;表明菌肥拌种处理能提高太子参块根氨基酸含量。张桂华等用988生物菌肥拌种处理玉米鲁原单22和登海11，与未经拌种处理的玉米相比，其产量以及赖氨酸、粗蛋白、粗淀粉、粗脂肪含量均有增加[20]。左烨研究发现，菌肥与化肥配施对大棚辣椒产量和品质[氨基酸、维生素C含量]提高效果明显[21]。本试验与上述试验均表明，菌肥能改善作物产量和品质。

2.3 菌肥对块根多糖含量的影响

由图3可知，处理和对照块根的多糖含量分别为 8.31%、8.01%，处理的含量稍高于对照。田雪莲等的研究表明，与使用化肥相比，微生物菌肥+化肥混施能提高番茄产量以及果实总糖含量，而株高、开展度、茎粗、维生素C含量、可溶性固性物含量、番茄红素含量等指标基本没有改变[22]，本试验在太子参块根产量、糖含量方面的试验结果与之相似，进而说明微生物菌肥在改善植物产量和品质方面有正向的作用。

2.4 菌肥对块根皂苷含量影响

由图4可知，处理和对照块根中皂苷含量分别为 2.22%、1.01%，两者含量间存在显著差异。前人的研究表明，耕作制度、施肥类型[23]、氮磷钾（NPK）肥料用量[24]等均会影响植物体内皂苷的含量，而本试验则发现，菌肥的施用有助于提高常规施肥水平下太子参块根皂苷的含量，这可为太子参优质生产提供合理的栽培管理技术。

2.5 菌肥对块根环肽含量的影响

由图5可知，处理和对照块根中环肽（亮氨酸）含量分别为0.007 43%、0.007 95%，处理的环肽（亮氨酸）含量略低于对照。表明微生物菌肥的施用并不一定有助于植物特定化学成分含量的提高，这与Kandeel等的研究结果[25]相似。

2.6 菌肥对块根微量元素含量的影响

表1表明，處理的微量元素Mn、Fe含量显著高于对照，而二者Cu、Zn的含量差异不显著，说明菌肥处理对太子参块根中微量元素Mn、Fe的含量有提升作用。Yildirim等联合应用根际促生菌和氮肥来研究其对结球甘蓝（Brassica oleracea var. capitata L.）生长、产量和化学组分的影响，结果表明，与未施用微生物的对照相比，促生菌的施用（浸种或幼苗沾根）对植株生长、产量以及体内营养元素N、Na、K、Ca、Mg、P、Fe、Cu、M、Zn的含量增加均有促进作用，这种促进作用因营养元素和促生菌施用方法的不同而有所不同，一般来说，通过促生菌幼苗沾根处理的植株叶片营养元素含量大于浸种处理，而Cu、Zn则通过浸种处理获得最大含量，Mn含量则表现为由于促生菌的处理而下降[26]。本试验所得到的太子参块根Mn、Cu、Zn含量变动情况与之不同，其原因可能与施用的促生菌种类、植物种类、化学肥料等多个因素有关。

3 结论与讨论

本试验结果表明，在太子参常规种植中（施用化学肥料），增加菌肥拌种处理措施不仅能提高太子参生物量，还对太子参品质（氨基酸、皂苷、多糖含量及微量元素Mn、Fe含量）有改善作用，这与黄冬寿在太子参上施用菌肥的研究结果[27]相似。除此之外，菌肥的拌种增产效果在其他作物，如小麦[28]、青稞以及豌豆等[29]上均有报道。在所有这些研究报道中，菌肥拌种对植物产生的促生作用与菌肥功能微生物在土壤地力和肥料养分利用率方面的改善是分不开的[30]。而本试验结果显示的菌肥促生功能，与菌肥中不同功能微生物的固氮、溶磷、解钾、抑制太子参根腐病原菌的作用[11]密不可分。

菌肥的增施不但能稳定植物产量，且对植物品质也产生一定的影响。如木霉属（Trichoderma）菌肥与适当比例的N、P、K复合肥配合施用能获得高于单施N、P、K复合肥的番茄产量，且使果实品质（全糖、维生素C、β-胡萝卜素、番茄红素等含量）有所改善[31]。而范新翔等的研究结果表明，菌肥拌种不仅能促进辣椒和小白菜植株生长、根系发达、根茎加粗、分枝数增加、开花提前和花蕾数增多等，而且对提高产量和改善品质也有明显效果[32]。Su等对经过印度梨形孢（Piriformospora indica）处理的欧洲油菜（Brassica napus L.）植株的品质相关指标进行测定，结果表明，印度梨形孢能增加N、Ca、Mg、P、K、S、B、Fe、Zn元素的含量，但降低芥子酸、芥子油甙的含量，进一步的实时定量PCR分析结果表明，与芥子酸合成相关的2个代谢酶基因Bn-FAE1和BnECR的表达量下调[33]。在本试验中，菌肥拌种对太子参品质有改善作用，可提高太子参块根氨基酸、多糖、皂苷、Mn、Fe含量，但其具体的作用机制有待进一步研究。

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