自动化抗酸染色系统与手工染片法检测性能的比较

袁晓华，左 芳

(1.鄂东医疗集团黄石市中心医院/湖北理工学院附属医院临床输血科，湖北黄石 435000;2.武汉科技大学，湖北武汉 430000)

肺结核是结核分枝杆菌(MTB)引起的肺部疾病。世界卫生组织统计，2016年全球有1 040.00万例新发结核病例，且37.40万人死于MTB[1]。我国在2011年第5次结核病流行病学抽样调查结果也显示，结核病发病人数约为130万人，占全球发病人数的14.3%[2]；每年因结核病而死的患者人数达13万人，是仅次于印度的世界第二大结核病高发国家[3]，而且人类免疫缺陷病毒(HIV)死亡患者中有1/3是由肺结核感染引起的[4]。因此，结核病的早期准确诊断和治疗在防治中起着关键的作用[5]。根据肺结核的诊断标准，结核病的病原学检查是结核病确认病例的必备条件[6]。而抗酸染色又是国内大多数医院用于检测体液或组织中抗酸杆菌的主要方法[7]。同时抗酸染色检查还存在操作复杂、技术要求高等缺点[8]。因此，黄石市中心医院(下称本院)运用自动染片系统进行抗酸染色，期望达到与手工抗酸染色一样的检测性能，且能缩短检测时间，提高检验效率。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年3月本院呼吸内科普通住院患者的样本300例，其中痰样本233例，肺泡灌洗液67例。

1.2仪器与试剂 Mycol T STAINER自动染片系统及配套抗酸染液(批号2016121301)购自上海皓信生物科技有限公司。TXD3细胞涂片离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。手工抗酸染液试剂盒(批号415091)购自珠海贝索生物技术有限公司。BX41显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.3方法

1.3.1痰液的样本处理 每例患者取清晨第一口痰，先用清水漱口，再用力咳出深部痰液0.5～3.0 mL于无菌痰杯内，及时送检。将专用竹签从中折断，用断处的茬面挑取样本中的脓样、干酷样、血样等可疑部分，在玻片正面垂直均匀涂抹成10 mm×20 mm卵圆形痰膜。自然干燥后，将玻片5 s内置于火焰上烤4次进行固定。每个样本制片2张。

1.3.2支气管肺泡灌洗液的样本处理 收到呼吸内科纤支镜室送检的支气管肺泡灌洗液样本后，将试管轻轻颠倒混匀，取0.9 mL灌洗液加入细胞涂片离心机的漏斗中，2 000 r/min,离心10 min，拿出漏斗和滤纸，取下制好的涂片。自然干燥后，同痰样本一样固定。每个样本制片2张。

1.3.3抗酸染色 手工染片法，首先滴加石炭酸复红，染色30 min后水洗，接着用3%盐酸乙醇脱色2次，每次1 min，2次脱色都用水洗。最后用美蓝复染0.5 min后水洗，自然干燥，记录用时。自动染片法，将涂片分批插入自动染片机的转盘中。选择数字后按开始键，染片机集染色、加热、脱色、复染、干燥于一体，染色完成后记录用时。每次手工法或自动法染色时用自制的阳性质控片进行质量控制[9]。阳性质控片预先准备，用临床抗酸杆菌阳性程度+++～++++的痰液涂片制作，热固定后不染色，置于密闭的玻片盒内于4 ℃冰箱内储存。

1.3.4阅片 采用双盲法对300例样本的600张玻片用油镜进行镜检，根据《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[10]和上海地区综合性医院结核病实验诊断操作规范[9]。观察300个视野，镜下见抗酸杆菌为阳性，未见为阴性，只统计阴、阳性，不统计阳性程度。

1.4统计学处理 采用SPSS16.0软件对数据进行统计学分析，计数资料以例数表示，采用Fisher′s确切概率法。用成组χ2检验，P<0.05为两种染色方法的结果有相关性。用配对资料的McNemar检验，P<0.05为两种染色方法的差异有统计学意义。用Kappa检验来分析两种染色方法结果之间的一致性，P<0.01为一致性有统计学意义，当Kappa值≥0.75时为一致性好，0.75>Kappa值≥0.4时为一致性一般，Kappa值<0.4时为一致性较差。以样本阳性率为对照组，两种方法各自的阳性率为实验组，绘制两种方法的受试者工作特征曲线(ROC曲线)，计算曲线下面积(AUC)。

2 结 果

2.1相关性 233例痰和67例肺泡灌洗液用手工法和自动法平行进行抗酸染色。手工法检出痰阳性10例，灌洗液阳性9例，阳性率分别为4.29%和13.43%。自动法检出痰阳性9例，灌洗液10例，阳性率分别为3.86%和14.93%。成组χ2检验，痰样本χ2=163.1，P<0.01，灌洗液样本χ2=59.26，P<0.01。说明两种方法的染色结果有相关性。

2.2McNemar检验 检验结果痰和灌洗液的P>0.05，为两种抗酸染色法，结果的差异无统计学意义，Kappa检验，检验结果痰和灌洗液P<0.01，Kappa值分别为0.835、0.939，为两种抗酸染色法的一致性有统计学意义，且一致性好。见表1、2。

表1 两种方法染色233例痰样本的结果

表2 两种方法染色67例灌洗液样本的结果

2.3诊断效能 设两种染色方法其中任意一种阳性，即认定为样本阳性，计算样本阳性率，痰和灌洗液的样本阳性率分别为4.72%和14.93%。以样本阳性率为对照组，以两种方法各自的阳性率为实验组，绘制ROC曲线。手工法和自动法的AUC都为0.952，见图1和表3。说明手工法抗酸染色和自动法抗酸染色的诊断效能相同。

图1 两种方法染色300例样本的ROC曲线

2.4用时比较 300例样本，手工法平均用时46 min/n，自动法平均用时12 min/n，自动法比手工法节省74%的耗时。

表3 两种方法染色300例样本的AUC和P值

3 讨 论

目前，临床上已经有了几种新的方法能快速诊断结核分枝杆菌，如实时荧光定性PCR在检测低排菌量标本时具有明显优势[11]。只是检测成本较高，在一些经济欠发达的地区并不适用[12]。抗酸染色检测因其较高的特异度、方便快捷的可操作性、生物安全要求低，在诊断分枝杆菌的感染中仍起着重要的临床作用[13]。有文献指出，抗酸染色的检测性能与多色巢式实时荧光定量核酸扩增法(Xpert MTB/RIF)的符合率为90.93%[14]。它作为一个传统的方法仍不可丢弃[15]。痰涂片抗酸染色还是判定结核患者预后的重要临床监测指标[16]。韩莹等[17]报道，近几年抗酸染色涂片阳性患者逐年递增，提示受感染者有扩大的趋势。因此，如何准确、快速地进行抗酸染色检测，仍是临床研究的目标。

本文收集了233例痰样本。另外考虑到普通痰样本的阳性率低，阳性样本太少，因此又收集了67例阳性率较高的肺泡灌洗液样本。使用手工法和自动法各染色涂片300张，采用双盲法进行阅片比较。结果，痰和灌洗液样本，手工法阳性率分别为4.29%和13.43%。自动法阳性率分别为3.86%和14.93%。成组χ2检验说明两种方法的染色结果有相关性。McNemar检验说明两种方法染色结果的差异无统计学意义，Kappa检验说明两种方法的一致性有统计学意义，且一致性好。另外，设两种染色方法其中任意一种阳性即认定为样本阳性，计算样本阳性率，以样本阳性率为对照组，手工法和自动法的阳性率为实验组，绘制ROC曲线。结果手工法和自动法的AUC都为0.952。两种方法的ROC曲线完全重合，虽然由于样本量小的原因，这种重合有着偶然性。但也说明了手工法抗酸染色和自动法抗酸染色的诊断效能相同，自动化抗酸染色系统可以代替手工抗酸染色法进行临床检测，与戴芸等[18]研究的结论一致。

自动染片系统耗时短，染色过程仅8～12 min。比手工法节省74%的用时。每次可同时染12或24片，另外，全封闭系统，集加热、甩干一体，不需要接近水池。比起手工法，使用染料少，污染环境小。因此，本文认为，运用自动染片系统进行抗酸染色，由于其操作简便，耗时短，较容易建立标准化，诊断效能和手工法相同，提高了检验效率，值得临床推广。