血清HE4与miRNA-21在上皮性卵巢癌中的表达及相关性研究

吴 玉，刘庆峰，李雨婷

(1.广州市红十字会医院检验科，广东广州 510220；2.广州医科大学金域检验学院，广东广州 510182)

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，也是导致女性癌症死亡的第五大原因，其中，上皮性卵巢癌(EOC)占所有卵巢癌的90%，因其早期症状不明显，且进展迅速、易于播散等特点，通常确诊时大多数已进入中晚期阶段[1]。目前超声和糖链抗原125(CA125)检测是国内EOC常见的筛查手段[2]，但超声诊断灵敏度和特异度低，CA125在其他非卵巢恶性肿瘤及非肿瘤相关疾病中也有一定的阳性率，故在病理诊断前，寻找快速有效的EOC早期诊断实验室指标具有十分重要的意义。

已有大量研究表明人附睾蛋白4(HE4)在EOC患者血清中高度表达，可作为EOC早期诊断、病理分期及预测肿瘤转移和预后的生物学指标[3-4]。近年来，有少量研究表明，微小RNA-21(miRNA-21)水平的表达与EOC临床分期、淋巴转移存在明显相关性[5]。但目前关于HE4和miRNA-21在EOC中相关性研究报道甚少，因此，本文旨在探讨HE4和miRNA-21在EOC中的表达变化以及相关性研究，以期为EOC的早期诊断和临床治疗提供新的观察指标。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年3月至2018年3月在广州市红十字会医院(下称本院)肿瘤科和妇科二区收治的80例临床资料完整的初诊EOC患者作为试验组，年龄32～65岁，平均(52.6±7.31)岁;病理组织学分型，浆液性腺癌42例，黏液性腺癌38例；依照国际妇产科联盟(FIGO)临床分期标准[6]，Ⅰ期17例，Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期35例；无淋巴结转移者49例，有淋巴结转移者31例。随机选取同时期本院收治的40例良性卵巢肿瘤患者作为良性组，30例体检健康者作为对照组。良性组患者年龄36～62岁，平均(53.2±6.59)岁；对照组患者年龄(34～64)岁，平均(54.5±6.05)岁。3组患者在年龄等基线资料方面差异无统计学意义(P>0.05)。

纳入标准：(1)试验组和良性组均为初诊卵巢肿瘤患者，均经组织病理学检查确诊；(2)所有患者或家属均知情本次研究，并签署知情同意书。排除标准：(1)合并有其他感染性疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、严重贫血等血液系统疾病、血栓及出血性疾病者；(2)入院前使用抗菌药物、抗凝药物、激素、含氮药物及大量失血等影响各指标检测结果者。

1.2仪器与试剂 罗氏cobas e601全自动化学发光仪及配套试剂购于德国罗氏诊断有限公司；Trizol试剂盒购于美国Invitrogen公司；DNA提取、逆转录、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录-聚合酶链式反应(q-PCR)试剂盒和miRNA-21试剂盒均购于美国ABI公司；引物由上海生工公司合成。低温高速离心机购于长沙湘仪仪器公司，小型超速离心机及移液器购于德国eppendorf公司，real-time PCR检测仪ABI 7500购于美国ABI公司，minicycler PCR扩增仪购自美国Perkin Elmer公司。

1.3血清HE4检测 所有研究对象均于清晨空腹采集3 mL静脉血置于促凝管中，4 000 r/min离心10 min，留取上清进行HE4水平的检测。检测采用电化学发光法，仪器及试剂为罗氏cobas e601全自动化学发光仪及配套试剂。操作严格按照实验室标准化文件进行，并每日进行质量控制，所有结果均为当日质量控制在控结果。q-PCR检测miRNA-21的方法描述要简化，属于试剂盒范畴的内容可以简略描述。

1.4q-PCR检测miRNA-21 将500 μL血清样本加入1 mL总RNA提取液中，根据Trizol试剂盒的说明书进行总RNA的提取，紫外线分光光度计A260/A280比值下测量A值计算总RNA纯度及浓度的检测。(1)使用Poly(A)Tailing Kit试剂盒按说明书进行5′末端加尾。(2)cDNA合成：使用TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit试剂盒按照说明书进行逆转录反应合成cDNA，整个过程于冰上完成，逆转录的条件为:16 ℃ 30 min;42 ℃ 30 min;85 ℃ 5 min。(3)q-PCR反应：使用20 μL反应体系，循环条件为:95 ℃变性15 s，60 ℃条件下退火或延伸1 min，进行40个循环。试验在不同时间点进行至少3次重复，计算各组2-△△Ct值。miRNA-21检测引物按相关参考文献[7]合成，见表1，miRNA-21内参基因为U6。

表1 HE和miRNA-21引物序列

2 结 果

2.1各组患者血清HE4和miRNA-21表达的比较 试验组血清HE4水平和miRNA-21相对表达量明显高于良性组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；良性组和对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2试验组患者血清HE4和miRNA-21表达与临床病理特征的关系 试验组患者临床Ⅲ～Ⅳ期、浆液型和有淋巴结转移患者血清HE4和miRNA-21表达水平明显高于临床0～Ⅱ期、黏液型和无淋巴结转移患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 各组患者血清HE4和miRNA-21表达的比较

注：*与良性组和对照组相比较,P<0.05

表3 试验组患者血清HE4和miRNA-21表达与临床病理特征的关系

2.3EOC患者血清HE4和miRNA-21的相关性分析 Pearson分析发现血清HE4和miRNA-21间呈正相关性(r=0.264，P=0.018)。见图1。

图1 EOC患者血清HE4和miRNA-21的相关性分析

3 讨 论

卵巢癌是妇科肿瘤所致死亡的主要原因，而与其恶性生物学行为相关的机制尚不清楚。EOC是卵巢癌的主要病理类型，其早期诊断有助于疾病的早期治疗、改善预后以及挽救患者生命。目前，血清肿瘤标志物筛查是EOC的主要筛查指标，但其灵敏度和特异度等原因，肿瘤标志物CA125用于EOC的诊断时仍具有局限性，故寻找新的生物学指标对EOC的辅助诊断具有重要意义。

HE4是一种新兴临床肿瘤标记物，其在健康人体中的表达呈限制性，而在卵巢癌患者，尤其是浆液性卵巢癌患者的血清中的表达可达90%以上，因此被认为是EOC早期诊断、鉴别、治疗监测和预后评估标志物[8]。有研究通过绘制ROC曲线分析得出HE4对EOC具有较高的诊断价值，其灵敏度和特异度均超过80%，诊断结果优于CA125[9]。本研究中发现EOC患者血清HE4水平较卵巢良性肿瘤患者和健康体检者明显升高，且临床分期Ⅲ～Ⅳ期患者、浆液性卵巢癌患者和有淋巴转移患者的血清HE4水平显著高于临床分期0～Ⅱ期患者、黏液性卵巢癌患者和无淋巴结转移患者。这与陈静[3]的研究结果一致，表明血清HE4水平可用于EOC患者临床分期、病理分型和肿瘤转移监测。

miRNAs为非编码短序列RNAs，其生物学功能差异表达在各种疾病的发生中均发挥着作用，通过与靶基因的mRNA作用，使得靶基因的mRNA发生降解，从而影响基因表达网络的调控，涉及的调控机制复杂多样[10]。目前，miRNA在EOC中的研究逐渐受到人们的关注，包括miRNA-200、miRNA-30等[11]，miRNA-21在ECO中的作用逐渐受到人们的重视。万冬等[12]采用q-PCR和Western blot方法检测了miRNA-21在卵巢癌中的表达，结果发现卵巢癌患者可通过miRNA-21的上调，从而抑制程序性细胞死亡因子4(PDCD4)基因的表达，从而促进卵巢肿瘤细胞增殖。于晓敏等[13]研究了血清miRNA-21的表达与EOC患者化疗耐药性及临床病理特征的关系，结果表明miRNA-21水平在EOC患者中明显升高，其可作为化疗耐药的的预测参考指标。本研究中发现EOC患者血清miRNA-21水平较卵巢良性肿瘤患者和体检健康者明显升高，且临床分期Ⅲ～Ⅳ期患者、浆液性卵巢癌患者和有淋巴转移患者的血清miRNA-21水平显著高于临床分期0～Ⅱ期患者、黏液性卵巢癌患者和无淋巴结转移患者。这与曾玉等[5]、林丽慧等[14]的研究结果一致，表明血清miRNA-21可用于EOC的早期诊断和病情监测。

目前关于血清HE4和miRNA-21联合检测对EOC诊断价值的相关报道甚少。本研究中，研究者通过Pearson相关性分析发现血清HE4和miRNA-21水平间呈正相关性(r=0.264，P<0.05)，与CHEN等[15]的报道结果相一致。这表明HE4和miRNA-21在卵巢癌的发生发展中起着重要重要，且二者间存在密切联系，具体机制有待研究人员的进一步研究。本研究尚未分析血清HE4和miRNA-21以及二者联合对EOC的诊断价值，此为本次研究的不足之处，笔者将在后续的研究中进行进一步的数据统计分析，以期为提高EOC的临床诊断价值提供理论依据。

综上所述，血清HE4和miRNA-21的高表达与EOC的发生发展密切相关，且二者间存在明显正相关性，可作为EOC诊断、转移和预后的生物学指标。