几种园艺植物细胞学鉴定

方 庆

（商丘职业技术学院，河南 商丘476100）

引言

随着生物科技的发展，人类对生物的研究已经由生物个体、细胞、染色体转向分子领域.目前，几乎每个生物学科都在运用染色体核型分析技术研究染色体，试图从微观方面了解更多的有关生命的奥秘.在园艺作物上，商宏莉、郭英发表了《6个无花果品种的染色体组型研究》［1］；牛学南发表了《百合科三种植物的核型分析》［2］；戴小红发表了《百合三品系代表品种的核型分析》［3］；李国泰发表了《大叶芹染色体的核型分析》［4］；汪卫星发表了《番木瓜的核型分析》［5］及《轮叶党参染色体核型分析》［6］；吕芳德发表了《山核桃属部分种的核型分析》［7］；申定健发表了《柑桔属6种植物染色体核型比较分析》［8］……综合以上研究者的研究，可以看出他们所研究的对象不同，但所用方法基本相似（核型分析），要进行核型分析研究，则必须先做好细胞染色体压片工作.做好染色体压片是进行核型分析的前提和关键.

目前，根尖细胞压片技术广泛运用在植物染色体分析上，但此压片技术在操作程序、取材时间、解离时间等方面都可以提出不同的处理方法［9-11］.因此，我们于2018年4至6月期间对大蒜等几种材料的染色体压片方法进行了研究，对其进行细胞染色体核型分析，拟找到最好的压片程序及方法，为进行核型分析及下一阶段试验奠定坚实的基础［12-13］.

1 材料与方法

1.1 材料

采用豌豆根尖、大蒜根尖、石榴根尖和茎尖为试验材料.

1.2 方法

1.2.1 取材

取正在生长的根尖1cm-2cm，在一天之中的不同时间进行取材.

1.2.2 预处理

用0.002mol／L 8-羟基喹啉30℃处理2.5h.

1.2.3 固定

放在固定溶液中固定20min-40min，洗净其醋酸后移入70%酒精中保存.

1.2.4 解离材料在50%酒精中浸泡5min，再用蒸馏水洗涤1min，后转入1mol／L冷盐酸（室温）浸泡1min，再转入1mol／L盐酸（60℃恒温）浸泡40min，接着转入1mol／L冰盐酸浸泡1min，再接着置于2%果胶酶水溶液中，在室温下处理30min，最后取出洗涤1-2次.

1.2.5 染色

一般情况下，经过固定的材料马上进行染色效果较好（染色清晰而且染色体易分散）.若经体积分数70%的酒精长期保存后，虽然细胞质也容易着色，但染色体会有不同程度的黏结，所以分散性差.本试验是将固定好的材料用蒸馏水反复洗几遍，然后将材料放入已预热至60℃的1M HCL中保温10min左右，然后用常温1M HCL洗1次，最后把材料转入Schiff试剂中，在10℃黑暗条件下染色1h-5h.染色结束后将材料转到蒸馏水中或45℃的醋酸中.

1.2.6 压片

给被染色后的材料盖上盖玻片放在平整的桌面上，在盖玻片上盖两层吸水纸，用左手手指压紧，防止盖玻片滑动，然后用右手持一解剖针，用针柄轻敲盖玻片，使材料均匀分散开及细胞分散压平.也可用右手的拇指轻压盖玻片，使材料分散.

本试验按传统染色方法将解离后的根尖放置在载玻片上，同时用刀片切取1mm-2mm根尖，滴加1滴配置好的染液，并用解剖针捣碎根尖.放置约10min，待根尖染成暗红色，加盖玻片，用吸水纸放在盖玻片上面，用右手拇指在吸水纸上对准根尖轻压，或用铅笔柄端轻轻敲击，将根尖材料压成一均匀薄层，注意不要移动盖玻片（为了观察方便，可在盖玻片下垫一张白纸）.

1.2.7 镜检

一般来说，在制成的染色体玻片标本中，染色清晰而且分散良好的中期分裂相总是少数，所以，在压片之后需要认真地进行镜检.镜检时先用低倍镜进行观察，找到一个好的视野后再转用高倍镜观察.合格的压片，可用防水墨水在盖片和载片的交界处划线作记号，作为制作永久压片时封片的标记.

一张优良的细胞染色体压片至少应符合如下条件：

1）在一张压片中应有较多的中期分裂相；2）染色体分散而不重叠；3）染色体不扭曲、断裂，主缢痕、随体等清晰；3）压片基本上为一层平展的细胞，观察时视野内所看到的细胞都处在一个平面上；4）染色体着色较深，而细胞质不着色或着色很浅，背景清晰无过多杂质.

1.2.8 染色体观察

将载有样品的玻片置于显微镜下观察，若染色较浅，可从盖玻片一侧加洒液，同时在另一侧用滤纸吸引染料，还可将载玻片在酒精灯上微微加热，这样染色体着色效果会更好些.如果分散不够，难以计数，可取下载玻片，重新铺上吸水纸，再次敲打，必要时也可用手指从吸水纸上对盖玻片施加适度压力，如此常会得到十分满意的结果.但须注意，手指压力不可过大，否则会压破细胞，造成染色体的流失、断裂或卷曲变形.

2 结果分析

2.1 不同材料根尖细胞压片效果比较

如图1、2、3所示，可以清楚地看出：用大蒜根尖细胞所做的压片最好；其次是豌豆；最差的是石榴.主要原因在于木本植物（如石榴）比草本植物的根尖细胞壁的纤维素层致密，不易解离和捣碎.

图1 石榴根尖细胞

图2 豌豆根尖细胞

图3 大蒜根尖细胞

2.2 不同解离时间对材料捣碎难易程度的影响

草本植物根尖较易捣碎，显微镜下细胞分散良好，观察效果清晰，木本植物根尖则较难捣碎，尤其是木本植物的茎尖更难捣碎.材料越易捣碎越容易做切片.因此，一般多用根尖做切片.从表1可以看出，解离时间对材料的捣碎程度有显著影响，解离时间越长材料越易捣碎.（说明：解离是指用盐酸浸泡材料.另外，解离后的材料，需15min-20min捣碎为难捣碎；10min-15min捣碎为较难捣碎；5min-10min捣碎为中等捣碎；2min-3min捣碎为易捣碎）通过对材料捣碎难易程度的把握，可以筛选出适宜材料的解离时间.

表1 解离时间对材料的影响

2.3 经酶处理与未经酶处理的切片效果比较

用0.2%果胶酶对大蒜、豌豆和石榴的根尖细胞处理30min，并与未处理的根尖细胞作对照，可以看出，经过酶处理的根尖细胞切片效果较好.因为果胶酶可以溶解细胞壁果胶质成分，从而使细胞壁解体，在显微镜下可以清晰看到细胞核部分，周围有细胞壁轮廓.如图4、5所示：

图4 未处理的豌豆根尖细胞

图5 处理过的豌豆根尖细胞

3 讨论与结论

3.1 讨论

3.1.1 材料的准备和选择

通过试验发现，在选择制片材料时，其准备工作较为复杂.如果材料的新根生长慢或因休眠等原因而未能长出新根，则影响试验的进行；石榴的种子长出的新芽易发生褐变，也会影响到试验观察效果.另外，通过试验我们发现，在一天之中，晚上取材比早上和中午取材效果好，三者由好到差依次为晚上＞早上＞中午.在试验过程中，试验需要用到的最重要的器材是显微镜，通过反复试验对比发现，如果要清晰地观察细胞染色体结构，必须使用高放大倍数和分辨率的显微镜.

3.1.2 操作中注意事项

为了在切取根尖时便于操作，同时为了防止在固定以及解离过程中材料的丢失，应该切取较长根尖（一般1cm-2cm）.在染色压片时，切取最短根尖（大约1mm-2mm），最好使用放大镜等工具加以辅助，以便准确地切取最顶端根尖.因为石榴茎尖顶端的生长点不明显，只有左右对称的两片嫩叶（自动封顶现象），因此，可用顶端上部叶腋内的侧芽生长点代替.

3.1.3 解离时间的把握

解离时间的长短直接影响后续的捣碎操作的难易程度和压片效果的好坏.若解离时间不足，捣碎困难，压片会出现未分开的组织块，时间过长则不利于制作.解离时间应视材料而定 ，一般木本植物材料解离时间应适当延长，草本植物材料解离时间应适当缩短.

3.2 结论

实验结果表明：1）一般情况下，用草本植物的根尖细胞做压片材料比木本植物效果好；2）制作压片效果的好坏取决于解离的好坏和捣碎的程度；3）对于同一植物材料，在一定的范围内，解离的时间越长捣碎分散细胞的效果越好，用0.2%果胶酶处理30min的细胞压片较未经0.2%果胶酶处理30min的效果好，其细胞核暴露完全.