不同囊胚形成时间对冻融单囊胚移植周期妊娠结局的影响

陈培林，孙青，熊风，李观贵，钟惠娴，万才云，姚志鸿，曾勇*

(1. 深圳中山泌尿外科医院生殖中心，深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳 518045；2. 深圳中山生殖与遗传研究所，深圳 518045)

辅助生殖技术中的多胎妊娠问题与多种并发症的发生密切相关，对母婴的健康造成极大的威胁，引起大家的普遍关注[1-2]。选择性单囊胚移植被认为是解决辅助生殖多胎妊娠的有效方法[3-4]。然而，要保证单囊胚移植的临床妊娠率，就必须挑选出种植潜力最好的囊胚用于移植。

在人类早期胚胎发育过程中，胚胎发育速度不尽相同，这就导致囊胚形成时间并不一致。不同时间形成的囊胚其种植潜能是否存在差异，目前仍存在争议[5]。针对该问题，本研究回顾性分析2013年1月至2017年8月，在深圳中山泌尿外科医院行冻融单囊胚移植的1 761个周期的临床资料，探讨不同囊胚形成时间对冻融单囊胚移植周期临床结局的影响。

资料与方法

一、研究对象

收集2013年1月至2017年8月在深圳中山泌尿外科医院行冻融单囊胚移植的患者。入选标准：移植胚胎为第5天(D5)或D6形成的囊胚。排除标准：移植胚胎为D7形成的囊胚。共纳入1 761个周期。本研究纳入患者在治疗开始前均经伦理委员会批准通过，及患者知情同意。

二、研究方法

1. 分组：根据囊胚形成时间分为2组，其中移植胚胎为D5形成囊胚的定义为A组(n=834)，移植胚胎为D6形成囊胚的定义为B组(n=927)。再根据两组移植囊胚的质量将A、B组分别分为两个亚组，其中移植胚胎为D5形成优质囊胚的定义为A1组(n=635)；移植胚胎为D5形成非优质囊胚的定义为A2组(n=199)；移植胚胎为D6形成优质囊胚的定义为B1组(n=418)，移植胚胎为D6形成非优质囊胚的定义为B2组(n=509)。

2. 囊胚培养：IVF或ICSI获得的胚胎，经患者知情同意后，全部或剩余胚胎行囊胚培养。D5和D6分别观察囊胚形成情况。

3.囊胚扩张程度评分：根据囊胚腔的大小及囊胚孵化程度，将其分为6个期，用数字1～6来表示。1期：早期有腔室囊胚，囊胚腔小于胚胎总体积的1/2；2期：囊胚腔体积大于或等于胚胎总体积的1/2；3期：完全扩张囊胚，囊胚腔完全占据了胚胎的总体积；4期：扩张囊胚，囊胚腔完全充满胚胎，胚胎总体积变大，透明带变薄；5期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分从透明带中逸出；6期：孵出的囊胚，囊胚全部从透明带中逸出。

4.内细胞团评分：根据细胞数量和紧密程度，分为3个级别，用字母A、B、C来表示。A级：细胞数目多，排列紧密；B级：细胞数目少，排列松散；C级：细胞数目很少。

5.滋养层细胞评分：根据细胞数量和紧密程度，分为3个级别，用字母A、B、C来表示。A级：上皮细胞层由较多的细胞组成，结构致密；B级：上皮细胞层由不多的细胞组成，结构松散；C级：上皮细胞层由稀疏的细胞组成。

6.囊胚评级：根据囊胚评分情况将囊胚分为3级。1级囊胚：3期及以上评分不含有C；2级囊胚：3期及以上评分中含有1个C的囊胚；3级囊胚：3期及以上评分中含有2个C的囊胚。其中评级为1级的囊胚定义为优质囊胚。

7.本中心的囊胚移植和冷冻标准：本中心只移植或冷冻评级1级或2级的囊胚。

8.囊胚冷冻与解冻：本中心冷冻解冻操作按照玻璃化冷冻、解冻试剂盒(Kitazato Biophama，日本)说明书进行。移植日当天解冻囊胚，行激光辅助孵化后放入Quinn’s囊胚培养液(SAGE，美国)中，置于37℃、5%CO2、5%O2的培养箱中培养1～2 h，观察囊胚扩张情况。

9.子宫内膜准备及囊胚移植：(1)自然周期：根据阴道超声检测，月经天数≥10 d，优势卵泡直径≥14 mm，子宫内膜达到7～8 mm以上，排卵后第5天进行冻融囊胚移植。(2)人工周期：月经第3日起口服戊酸雌二醇(补佳乐，拜耳制药，德国)4 mg/d×5 d，根据内膜情况调整剂量和天数。15 d后B超监测子宫内膜厚度7～8 mm以上时，肌肉注射黄体酮60 mg/d至移植日，第6天进行冻融囊胚移植。

10.囊胚移植及黄体支持：B超引导下行囊胚移植。自移植次日改用黄体酮凝胶(雪诺酮，默克雪兰诺，瑞士)90 mg/d阴道给药，直至移植后11 d测血β-HCG。

11.结局判断及观察指标：移植后11 d测血β-HCG，β-HCG≥5 U/L定义为β-HCG阳性。移植28 d后，超声下可见孕囊定义为临床妊娠。

HCG阳性率=β-HCG阳性周期数/移植周期数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；早期流产率=妊娠12周内流产的周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率=活产周期数/移植周期数×100%；早产率=早产周期数/活产周期数×100%。

三、统计学处理

结 果

一、单个优质冻融囊胚移植周期各组患者基本资料及妊娠结局比较

A1组与B1组患者的移植年龄、不孕年限比较均有显著性差异(P<0.05)，体重指数(BMI)比较则无显著性差异(P>0.05)(表1)。两组患者的妊娠结局比较，HCG阳性率、临床妊娠率、早期流产率、活产率及早产率比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表1 单个优质冻融囊胚移植周期各组患者基本资料比较(-±s)

注：与B1组比较，*P<0.05

表2 单个优质冻融囊胚移植周期各组患者妊娠结局比较(%)

二、单个非优质冻融囊胚移植周期各组患者基本资料及妊娠结局比较

A2组与B2组患者的不孕年限、BMI比较均无显著性差异(P>0.05)，移植年龄组间比较存在显著性差异(P<0.05)(表3)。两组的早期流产率、早产率比较均无显著性差异(P>0.05)，A2组的活产率显著高于B2组(P<0.05)，A2组的HCG阳性率、临床妊娠率极显著高于B2组(P<0.01)(表4)。

表3 单个非优质冻融囊胚移植周期各组患者基本资料(-±s)

注：与B2组比较，*P<0.05

表4 单个非优质冻融囊胚移植周期各组患者妊娠结局 (%)

注：与B2组比较，*P<0.05，**P<0.01

三、多因素Logistic回归分析

以临床妊娠为因变量，以女方移植年龄、不孕年限、女方BMI、囊胚形成时间做多因素Logistic回归分析。对于优胚组，女方BMI、不孕年限、囊胚形成时间对临床妊娠的影响无统计学意义(P>0.05)；而女方年龄[OR=0.895，95%CI(0.868，0.922)]对临床妊娠的影响有统计学意义(P<0.05)(表5)。对于非优胚组，女方移植年龄、女方BMI、不孕年限对临床妊娠的影响无统计学意义(P>0.05)；而囊胚形成时间[OR=2.240，95%CI(1.592，3.152)]对临床妊娠的影响有统计学意义(P<0.05)(表6)。

表5 多因素Logistic回归分析各因素对单个优质囊胚冻融移植临床妊娠率的影响

表6 多因素Logistic回归分析各因素对单个非优质囊胚冷冻移植临床妊娠率的影响

讨 论

多胎妊娠会引起多种并发症，严重威胁母婴健康，是辅助生殖技术中亟待解决的问题[1，6]。选择性单胚胎移植是目前解决多胎妊娠最有效的方法[3]，由于相较于卵裂期胚胎，囊胚移植具有更好的临床结局[7-8]，选择性单囊胚移植已成为大家关注的焦点。然而，减少移植胚胎数目势必会引起临床妊娠率的降低[4]，为保证囊胚移植的妊娠率，必须选择更具发育潜能的胚胎。目前对于胚胎发育潜能的评估多是基于胚胎形态学评分[9-10]，然而由于胚胎发育速度并不相同，这会导致相同评分的囊胚可能形成时间并不一致。囊胚形成时间的差异是否会影响囊胚移植的妊娠结局目前尚存在争议[5]。

2005年Barrenetxea等[11]的研究表明，对于新鲜移植周期，移植D5囊胚的妊娠结局显著好于移植D6囊胚。在冻融移植周期中，有研究认为移植D5、D6囊胚其妊娠结局无显著性差异[12-13]，而王雪等[14]的研究认为移植D5囊胚其临床妊娠率、种植率等指标均优于移植D6囊胚，李彩虹等[15]的研究也得到了类似的结论。谭巧等[5]对35周岁以下女性移植不同等级及不同形成时间冻融囊胚的临床结局进行了研究，结果显示优胚组D5囊胚的移植妊娠结局与D6囊胚类似，非优胚组D5囊胚的移植妊娠结局好于D6囊胚，但无显著性差异。本研究分析了不同囊胚形成时间对冻融单囊胚移植周期临床结局的影响，我们根据囊胚形成时间以及囊胚质量进行分组，研究结果显示对于优胚组，A1组移植D5囊胚的β-HCG阳性率(60.79% vs. 57.89%)、临床妊娠率(52.44% vs. 49.28%)、早产率(10.81% vs. 15.28%)等妊娠结局均有优于B1组的趋势，但尚无显著性差异(P>0.05)；早期流产率(22.22% vs. 23.79%)、活产率(34.96% vs. 34.45%)与B1组相似。A1组患者的年龄[(33.44±4.52) vs.(34.23±4.36)]及不孕年限[(3.24±2.52)vs.(3.87±3.14)]均显著小于B1组(P<0.05)，结合多因素Logistic回归分析结果，A1组妊娠结局略优于B1组，可能是年龄因素造成的(OR=0.895，P<0.01)，囊胚形成时间不会显著影响优胚组妊娠结局(OR=1.063，P>0.05)。

对于非优胚组，A2组D5囊胚移植的β-HCG阳性率(56.78% vs. 39.10%)、临床妊娠率(48.74% vs. 29.86%)、活产率(28.64% vs. 20.04%)均显著高于B2组(P<0.05)；两组的早期流产率(34.02% vs. 25.00%)、早产率(8.77% vs. 8.82%)比较均无显著性差异(P>0.05)。尽管两组年龄[(33.90±4.29)vs.(34.81±5.22)]存在显著性差异(P<0.05)，但结合多因素Logistic回归分析结果可以发现年龄并非影响该组临床妊娠的显著因素(OR=0.969，P>0.05)，而囊胚形成时间是影响两组间临床妊娠率差异的重要因素(OR=2.240，P<0.01)。

我们的结论与Yang等[16]的研究相似。究其原因，可能是不同形成时间囊胚的非整倍体率差异造成的。Yang等[16]的研究显示，在优胚组，D5、D6囊胚的非整倍体率并无显著性差异，而在非优胚组，D6囊胚的非整倍体率高于D5囊胚组。众所周知，非整倍体是导致胚胎凋亡、种植失败或自然流产的重要因素[17-18]。对于优胚组，由于D5、D6囊胚的非整倍体率并无明显差异，因此，无论移植D5囊胚还是D6囊胚其妊娠结局并无显著性差异。而对于非优胚组，由于D5囊胚有更低的非整倍体率，因此移植D5囊胚的妊娠结局显著优于移植D6囊胚。

综上所述，我们的研究显示在冻融单囊胚移植时，若移植胚胎为优胚，则囊胚形成时间对于临床结局无显著影响；但当移植囊胚为非优胚时，囊胚形成时间对临床结局有显著影响，此时选择D5形成的囊胚对临床结局更有利。当然我们的研究还存在一定的局限性，受限于样本数量，我们并未根据内细胞团和滋养细胞评分进一步分组，评估二者对妊娠结局的影响。有研究认为相同评级不同内细胞团和滋养层细胞的评分会造成妊娠结局的差异[19]，因此在非优质囊胚组中妊娠结局的差异可能由此因素造成，还需进一步研究确认。